交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌

祁軍，張霞，2，蔣剛強(qiáng)，蔡國(guó)瑞，董亞學(xué)，鄭文杰，*

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300461；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；3.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆烏魯木齊 830063）

志賀氏菌屬（Shigella）的細(xì)菌是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，根據(jù)Igor G 等研究，在成年患者中，只要10 cfu～100 cfu 的志賀氏菌就可通過(guò)感染腸道而致病[1]，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；在幼兒可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。志賀氏菌主要通過(guò)食物或水經(jīng)消化道傳播，導(dǎo)致食源性志賀氏菌流行，與志賀氏菌病相關(guān)的食品包括色拉、生蔬菜、奶及奶制品、水果、肉類、面包制品等。志賀氏菌可以分為痢疾志賀氏菌（S.dysenteriae）、福氏志賀氏菌（S.flexneri）、鮑氏志賀氏菌（S.boy dii）和宋內(nèi)氏志賀氏菌（S.sonnei）。在發(fā)展中國(guó)家，由福氏志賀氏菌引起的感染性腹瀉疾病高居首位[2]。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于食品中志賀氏菌的檢測(cè)方法需要2 d～3 d 才能得到初步結(jié)果，而隨著食品安全檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的提高，尋找更加快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)技術(shù)顯得至關(guān)重要。志賀氏菌的檢測(cè)方法很多，ELISA、常規(guī)PCR檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、RAPD、基因探針等技術(shù)均在志賀氏菌的檢測(cè)和研究中得到廣泛的應(yīng)用[3-10]。

隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，志賀氏菌的檢測(cè)和鑒定方法朝著快速簡(jiǎn)便、靈敏性高、特異性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。本研究應(yīng)用一種新的交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[11]，針對(duì)編碼4 個(gè)血清型的志賀氏菌主要毒力基因——侵襲性質(zhì)粒抗原H 基因（ipaH），建立一種既有分子生物學(xué)檢測(cè)的高靈敏、高通量，又具有免疫學(xué)檢測(cè)的特異性好、操作簡(jiǎn)捷，又不需要任何復(fù)雜儀器的快速檢測(cè)方法，以適用于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)快速篩查檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

dNTPs（Fermentas），10×Bst buffer（New England Biolabs），Bst DNA polymerase large fragment（New England Biolabs），MgSO4（Sigma），betaine（Sigma），核酸快速檢測(cè)試紙條（杭州優(yōu)思達(dá)公司）。

菌株采用志賀氏菌6 株（4 株CMCC 菌株、樣品中分離出的2 株野生株）及32 株其他相關(guān)陰性菌，詳見(jiàn)表1。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR 擴(kuò)增儀（Biometra）、離心機(jī)（Eppendorf，5417R）、DNA/RNA/蛋白分析儀（BHIMUZDA，Bio Specmini）。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取及定量

痢疾志賀氏菌CMCC 51252 為試驗(yàn)菌株，接種于10mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)16h，取1mL 用于細(xì)菌基因組提取，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 質(zhì)量及純度。

1.3.2 引物及探針的設(shè)計(jì)

以志賀氏菌EU743831.1 的invasion plasmid antigen（ipaH2）基因DNA 序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物序列：

1.3.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

通過(guò)優(yōu)化，反應(yīng)體系為：10×ThermoPol buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，100 mmol/L MgSO40.6 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，8U/μL Bst DNA pol 1 μL，2μmol/L SHIF3/SHIB3 0.5μL/0.5μL，20 μmol/LSHICPR20.6 μL，20 μmol/L SHIDF5F/SHIDF5B 0.5 μL/0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

反應(yīng)條件：64 ℃反應(yīng)60 min。

1.3.4 特異性試驗(yàn)

對(duì)表1 中菌株核酸樣本進(jìn)行試驗(yàn)，以證明檢測(cè)方法是否具有通用性及特異性。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)CMCC 51252 菌液取1 mL 做細(xì)菌計(jì)數(shù)，用PBS 對(duì)菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至10-8，取1 mL 提取細(xì)菌基因組做實(shí)驗(yàn)?zāi)０?。按照反?yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)六次。

1.3.6 干擾菌試驗(yàn)

取大腸桿菌43046，沙門氏菌50041，陰溝腸桿菌45301 共3 株菌作為干擾菌株，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)菌液濃度大約為108cfu/mL 左右，進(jìn)行10 倍梯度逐倍稀釋到濃度為107cfu/mL～101cfu/mL。

準(zhǔn)備3 個(gè)錐形瓶，3 個(gè)瓶中接入終濃度分別為（1）103cfu/mL 51252+105cfu/mL43046；（2）103cfu/mL 51252+105cfu/mL50041；（3）103cfu/mL 51252+105cfu/mL 45301 3 種干擾菌混合。取1 mL 混合液提取DNA 做實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，按照反?yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

用該研究建立的檢測(cè)方法體系與現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)來(lái)源于不同國(guó)家的不同種類食品的58 份實(shí)際樣品進(jìn)行普查檢測(cè)，確定該檢測(cè)體系的假陽(yáng)性率及假陰性率，客觀全面分析評(píng)估建立的檢測(cè)體系可操作性及準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)

檢測(cè)38 株實(shí)驗(yàn)菌株，其中6 株志賀氏菌檢測(cè)全部為陽(yáng)性，圖1 是志賀氏菌檢測(cè)結(jié)果；其余32 株陰性相關(guān)菌檢測(cè)為陰性，圖2 為部分腸桿菌科其他陰性菌株的試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明該方法特異性良好,而且對(duì)于志賀氏菌檢測(cè)具有很好的通用性。

圖1 志賀氏菌特異性檢測(cè)Fig.1 Specificity of detecting Shigella strains

圖2 非志賀氏菌特異性檢測(cè)Fig.2 Specificity of detecting for non-Shigella bacterial strains

2.2 靈敏度試驗(yàn)

2.2.1 純菌液靈敏度檢測(cè)

CMCC 51252 過(guò)夜菌液計(jì)數(shù)為7.3×108cfu/mL，用PBS 對(duì)菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至7.3×101cfu/mL，各取1 mL 提取細(xì)菌基因組做實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，結(jié)果見(jiàn)圖3，靈敏度達(dá)到103cfu/mL。

圖3 志賀氏菌CMCC 51252 菌液靈敏度試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity of detecting Shigella CMCC51252 in pure culture

2.2.2 干擾菌試驗(yàn)

對(duì)1.3.6 步驟的混合菌液進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明在干擾菌終濃度均達(dá)105cfu/mL 的情況下，檢測(cè)靈敏度沒(méi)有發(fā)生明顯變化，依舊為達(dá)103cfu/mL。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)58 份實(shí)際樣品進(jìn)行普查檢測(cè)，金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)生化檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性樣品4 個(gè)，該檢測(cè)方法陽(yáng)性結(jié)果6 個(gè)，兩種檢測(cè)方法結(jié)果大致相符，新建立的方法沒(méi)有漏檢情況，有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，但發(fā)生率較低，適用于樣品檢測(cè)初篩要求。

3 結(jié)論

隨著食品安全檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的提高，尋找更加快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)技術(shù)顯得至關(guān)重要。志賀氏菌的檢測(cè)方法隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，將得到不斷地改進(jìn)和完善，并朝著快速簡(jiǎn)便、靈敏性高、特異性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。

近年來(lái)，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的微生物學(xué)檢測(cè)得到較快發(fā)展，與傳統(tǒng)檢測(cè)手段相比，能更快發(fā)現(xiàn)食品中存在的微生物安全隱患。交叉引物結(jié)合免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)是一種新型的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，消除了PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR 對(duì)儀器的依賴，同時(shí)與環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）相比，其檢測(cè)結(jié)果的觀察更為直觀、客觀、便捷，只需依據(jù)試紙條上檢測(cè)線的有無(wú)即可明確判定陰陽(yáng)性結(jié)果，避免了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增使用肉眼觀察沉淀或顏色變化的主觀性。該方法不需要儀器設(shè)備及其高度靈敏、特異及快速的優(yōu)點(diǎn)對(duì)于普及分子生物學(xué)方法在基層和經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)具有重要的意義。

本研究根據(jù)1987 年Buysse 等發(fā)現(xiàn)志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒抗原H（ipaH）[12]基因建立交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增方法，具有較好靈敏度。該基因呈多拷貝存在于菌體的質(zhì)粒或染色體上，是志賀氏菌檢測(cè)中常用到的目的基因。許龍巖等[13]根據(jù)ipaH 基因序列設(shè)計(jì)引物建立PCR方法，特異性高，能檢測(cè)出志賀氏菌屬的4 個(gè)種群；趙麗華等[14]利用分子信標(biāo)PCR 方法以該基因?yàn)槟康幕?，檢測(cè)樣品準(zhǔn)確率達(dá)到100%。本研究建立檢測(cè)檢測(cè)方法無(wú)論有無(wú)干擾菌，檢測(cè)靈敏度均可穩(wěn)定達(dá)到103CFU/mL 可滿足樣品檢測(cè)需求。通過(guò)與金標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)比較，結(jié)果大致相符，沒(méi)有漏檢情況出現(xiàn)，但有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，發(fā)生率較低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備，適合于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)于樣品的快速篩選檢測(cè)。

[1]Igor G,Anders S,Alexander M,et al.A method for allelic replacement in Francisella tularensis[J].FEMS microbiology letters,2003,222(2)：273-280

[2]Bennish M L,Wojtyniak B J.Mortality due to shigellosis：community and hospital data[J].Rev Infect Dis,1991,13(4)：245-251

[3]秦巧玲,郭愛(ài)玲.志賀氏菌多克隆抗體制備及ELISA 檢測(cè)方法的建立[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2008

[4]Islam M S,Hossain M S,Hasan M K,et al.Detection of Shigellae from stools of dy sentery patients by culture and poly merasechain reaction techniques[J].J Diarrhoeal Dis Res,1998,16(4)：248-251

[5]Islam D,Lindbere A A.Detection of Shigella dy senteriae ty pe 1and Shigella flexneri in feces by immunomag netic isolation and polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol,1992,30(11)：2801-2806

[6]Yang Y G,Song M K,Park S J,et al.Direct detection of Shigella flexneri and Salmonella typhimurium in human feces by Real-time PCR[J].Journal of microbiol and biotechnol,2007,17(10)：1616-1621

[7]Song T,Toma C,Nakasone N,et al.Sensitive and rapid detectionof Shigella and enteroinvasive E scherichia coli by a loop-mediated isothermal amplification method[J].F E MS Microbiol L ett,2005,243(1)：259-263

[8]李燕俊,劉秀梅.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)及其在致病菌研究中的應(yīng)用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2005,32(5)：305-309

[9]李君文,晁福寰,史秀全,等.志賀氏菌的RAPD 鑒定研究[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2003,21(1)：12-15

[10]金大智,文思遠(yuǎn),王升啟.基因芯片技術(shù)在檢測(cè)腸道致病菌方面的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào),2006,46(3)：500-503

[11]Fang R,Li X,Hu L,et al.Cross-priming amplification for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimsal[J].J Clin Microbiol,2009,47(3)：845-847

[12]Hartman A B,Venkatesan M,Oaks E V,et al.Sequence and molecula characterization of a multicopy invasion plasmid antigen gene ipaH of Shigella flexneri[J].Journal bacterial,1990,172(4)：1905-1915

[13]許龍巖,李志勇,王志強(qiáng),等.PCR 方法檢測(cè)志賀氏菌的研究[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2003,13(5)：28-29

[14]趙麗華,周勇,萬(wàn)成松.分子信標(biāo)PCR 檢測(cè)志賀菌ipaH 基因[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2006,6(5)：499-502