骨碎補(bǔ)總黃酮對骨性關(guān)節(jié)炎血清IL－1、IL－8及TNF－a表達(dá)的影響＊

陳元良 張 壽 鐘海波 海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心（?？?70208）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis）是目前臨床上的一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)生率隨年齡的增高而增多，又名退行性關(guān)節(jié)病、增生性骨關(guān)節(jié)炎，老年性關(guān)節(jié)炎等。骨關(guān)節(jié)炎的病理表現(xiàn)為有軟骨退行性變的同時伴有新骨的形成。其早期臨床表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)僵硬，可以因勞累、受涼而加重，發(fā)病的常見部位有手、膝、髖、足、脊柱等。病情嚴(yán)重者即使在休息時都有關(guān)節(jié)痛和活動的受限，受累關(guān)節(jié)往往伴有壓痛、骨性肥大、骨性摩擦音、少數(shù)患者有畸形。骨碎補(bǔ)總黃酮是從水龍骨科植物的干燥根莖中提取出來的黃酮類化合物，目前有研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮可以抑制巨噬細(xì)胞分泌一定的細(xì)胞因子［1］。我們本次研究是通過觀察骨碎補(bǔ)總黃酮對骨性關(guān)節(jié)炎家兔模型血清中IL－1、IL－8及TNF－a的影響，研究骨碎補(bǔ)總黃酮對于防治骨性關(guān)節(jié)炎的意義，探討其治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性6個月齡的家兔32只，體重2.0～2.5kg，購自長沙市東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動物科技服務(wù)部。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑 骨碎補(bǔ)總黃酮膠囊（規(guī)格：0.25g／粒，生產(chǎn)廠家：北京歧黃制藥公司），維固力（規(guī)格：0.25g／粒，生產(chǎn)廠家：愛爾蘭羅達(dá)藥廠）、IL－8、IL－1、TNF－a試劑盒（購自武漢博士德公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將32 只實(shí)驗(yàn)動物按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，分別為正常對照組（A 組）、模型對照組（B組）、骨碎補(bǔ)總黃酮組（C組）和維固力組（D 組），每組均8只動物。

1.4 制備動物骨關(guān)節(jié)炎模型 家兔正常飼養(yǎng)1 周后，B組、C組、D 組均按照Hulth方法［2］進(jìn)行造模：先在腹腔注射苯巴比妥鈉（劑量為50mg·kg－1）進(jìn)行麻醉，麻醉成功后即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)家兔膝關(guān)節(jié)周圍脫毛處理（需嚴(yán)格按照無菌操作要求），脫毛完成后再進(jìn)行家兔膝關(guān)節(jié)周圍皮膚消毒，消毒后我們將實(shí)驗(yàn)家兔固定后在膝內(nèi)側(cè)做一切口，探查關(guān)節(jié)腔無原發(fā)病變后即切斷家兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除其膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)的半月板，再切斷膝關(guān)節(jié)十字交叉韌帶，閉合家兔膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)囊，用逐層縫合的方式縫合，最后用無菌敷料包扎固定。術(shù)后為了防止實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生術(shù)后感染，遂肌肉注射青霉素（按20萬U 的劑量），每天注射1次，連續(xù)7d。

1.5 給藥及取材方法 第4 周開始灌胃，正常對照組每日以生理鹽水6m·kg－1灌胃；模型對照組每日以生理鹽水6·kg－1灌胃；將骨碎補(bǔ)總黃酮與維固力這兩種藥物配制成溶液，實(shí)驗(yàn)動物每日的用藥量需按成人（體重為60kg）體表面積與家兔體表面積進(jìn)行換算，根據(jù)Meeh－Rubner公式A＝K×W2／3×10－4進(jìn)行計(jì)算。

骨碎補(bǔ)總黃酮治療組家兔給藥方式及劑量：灌胃骨碎補(bǔ)總黃酮溶液（6g·L－1）（按35mg·kg－1／d的劑量，相當(dāng)于成人劑量0.75g·d）；維固力治療組給藥方式及劑量：給予灌胃維固力藥液（12g·L－1）（按69mg·kg－1／d的劑量，相當(dāng)于成人劑量1.5g·d）。1d1次，共計(jì)4周。同時開始家兔患肢的被動屈曲。

取材方法：灌胃完成后心臟采血，每只實(shí)驗(yàn)家兔取約20血液，經(jīng)用6000r離心機(jī)離心20min后用已備好的EP 管取其上清液，－20℃保存。

1.6 檢 測 采用放免分析（ELISA）法。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

造模完成后，模型組、骨碎補(bǔ)總黃酮組和維固力組兔膝關(guān)節(jié)均明顯腫脹，皮溫升高，經(jīng)過8周的治療，骨碎補(bǔ)總黃酮組和維固力組癥狀逐漸減輕，全身狀況較模型組明顯改善。ELISA法測定結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組、骨碎補(bǔ)總黃酮治療組和維固力治療組家兔血清中IL－1、IL－8及TNF－a表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）。經(jīng)4周的灌胃治療后，骨碎補(bǔ)總黃酮治療組和維固力治療組的IL－1、IL－8及TNF－a表達(dá)與模型組比較有明顯降低（P＜0.01）；骨碎補(bǔ)總黃酮組與維固力組比較，IL－1、IL－8及TNF－a表達(dá)差異不明顯（P＞0.05），見下表。

表1 各組動物血清中IL－1、IL－8和TNF－a水平比較（±s）

表1 各組動物血清中IL－1、IL－8和TNF－a水平比較（±s）

注：與B組比較▲P＜0.01；與A 組比較△P＜0.01；C、D組比較P＞0.05

組別 n IL－1IL－8TNF－a A 8 0.021±0.003▲ 0.029±0.005▲ 0.015±0.004▲B 8 0.431±0.601▲ 0.602±0.714▲ 0.286±0.241▲C 8 0.025±0.004△▲0.031±0.004△▲0.005±0.003△▲D 8 0.029±0.005△▲0.038±0.003△▲0.068±0.004△▲

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是目前臨床上的一種常見病，多發(fā)病，是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，本病在中年以后多發(fā)。國內(nèi)的初步調(diào)查顯示，骨性關(guān)節(jié)炎的總患病率約為15%，40歲人群的患病率為10%～17%，60歲以上則達(dá)50%。而在75歲以上人群中，80%患有骨性關(guān)節(jié)炎。該病的最終致殘率為53%。臨床上以關(guān)節(jié)腫痛、骨質(zhì)增生及活動受限最為常見。骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病無地域及種族差異。年齡、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷及遺傳因素可能與本病的發(fā)生有關(guān)。對于這種疾病的病因醫(yī)學(xué)界目前尚未完全研究清楚。但近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在這種疾病的變化過程中，一些細(xì)胞因子如IL－1、IL－8、TNF－a等在患者關(guān)節(jié)組織由結(jié)構(gòu)性破壞到出現(xiàn)疼痛、腫脹、功能障礙等一系列的臨床癥狀過程中起著重要作用［3－5］。

白細(xì)胞介素（interleukin IL）是一種單核因子。由巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等多細(xì)胞產(chǎn)生，是常見的炎癥調(diào)節(jié)劑，有IL－1α和IL－1β兩種亞型。其中IL－1β在促進(jìn)軟骨降解，軟骨細(xì)胞分泌金屬蛋白酶等方面起主要的作用。IL－1多存在于血液和組織中，其可以在軟骨細(xì)胞的降解、退變過程中起到非常重要的分解作用。研究表明IL－1有三方面的功能與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)：①可以促進(jìn)機(jī)體合成基質(zhì)金屬蛋白酶同時并激活基質(zhì)金屬蛋白酶；②可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的合成，增加膠原蛋白的降解，最終破壞機(jī)體的關(guān)節(jié)軟骨［6］；③能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生前列腺素E 和中性蛋白酶，從而增加破骨細(xì)胞的活性，加重機(jī)體關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)。白細(xì)胞介素－8（interleukin－8，IL－8）是另一種重要的炎癥介質(zhì)，由滑膜中的巨噬細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，是人體內(nèi)重要的中性粒細(xì)胞趨化因子、通過增加細(xì)胞表面白細(xì)胞黏附因子表達(dá)，促使白細(xì)胞聚集，最終導(dǎo)致組織損傷。

腫瘤壞死因子（tumour necrosis factorTNF）是1975 年由CARSWELL和OLDY 發(fā)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)人TNF－α生物學(xué)活性與IL－1非常相似，主要由單核－巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，活化的輔助性T細(xì)胞也可以產(chǎn)生，可合成和釋放IL－1、IL－6、IL－8、血小板活化因子等，增加多形核白細(xì)胞的吞噬活性，并進(jìn)一步增加多形核白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，它與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)：①降解軟骨基質(zhì)；②激活多形核白細(xì)胞；③促進(jìn)滑膜細(xì)胞的PGE2產(chǎn)生；④誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子，如IL－1、單粒細(xì)胞刺激因子，而IL－1能提高TNF－α的活性，體外實(shí)驗(yàn)證明TNF－α與IL－1β有協(xié)同作用，能介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

從以上研究發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎的積極治療有效的抑制IL－1、IL－8、TNF－α等細(xì)胞因子的分泌，阻斷細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有密切的關(guān)系。中醫(yī)將骨性關(guān)節(jié)炎歸于“痹證”范疇，認(rèn)為膝關(guān)節(jié)主要涉及到筋與骨，與肝和腎聯(lián)系緊密。因此《素問·脈要精微論篇》：“膝者筋之府，屈伸不能，行則僂附，筋將憊矣。骨者髓之府，不能久立，行則振掉，骨將憊矣”，它發(fā)病的內(nèi)因一般為先天稟賦不足及正氣虧虛，久痹不愈后導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，病及臟腑，內(nèi)舍其合，肝腎虧虛，痰瘀互結(jié)。骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨的根莖。有補(bǔ)腎強(qiáng)骨及續(xù)傷止痛的功效，常用于筋骨折傷、腎虛腰痛、牙齒松動、跌撲閃挫等，現(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)對于骨關(guān)節(jié)炎的治療有積極的作用，主要原因在于：①骨碎補(bǔ)可以改變軟骨細(xì)胞的功能，骨關(guān)節(jié)炎軟骨有刺激細(xì)胞產(chǎn)生代償性增生的作用；②能部分改善由于力學(xué)應(yīng)力線改變造成的關(guān)節(jié)軟骨的退行性變，降低骨關(guān)節(jié)病的發(fā)病率及發(fā)病程度。由于以上的原因骨碎補(bǔ)可以在一定程度上延緩患者的發(fā)病時間。骨碎補(bǔ)的主要有效成分是骨碎補(bǔ)總黃酮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)：與正常對照組比較，模型組、骨碎補(bǔ)總黃酮治療組和維固力治療組動物血清中IL－1、IL－8及TNF－a表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）。經(jīng)4周的灌胃治療后，骨碎補(bǔ)總黃酮組和維固力組的IL－1、IL－8及TNF－a表達(dá)與模型組比較有明顯降低（P＜0.01）；骨碎補(bǔ)總黃酮組與維固力組比較，IL－1、IL－8及TNF－a表達(dá)差異不明顯（P＞0.05）。表明骨碎補(bǔ)總黃酮確實(shí)可以抑制炎性因子的分泌，阻斷骨關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過抑制IL－1、IL－8、TNF－α的釋放而實(shí)現(xiàn)的。

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