糖心樂對糖尿病心肌病大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2表達的影響＊

安 榮 孔 維 趙莉平 丁 雯 丁延平 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽712046）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCMP）是一種特殊類型的心肌病。實驗證明心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病變中起關(guān)鍵作用［1］，Bcl－2家族成員在凋亡過程中扮演重要角色，其中Bnip－3起促進心肌細(xì)胞凋亡的作用、Bcl－2起抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用［2］。中藥復(fù)方糖心樂（TXL）是陜西中醫(yī)學(xué)院王朝宏教授的經(jīng)驗方，按照中醫(yī)辨證與西醫(yī)辨病相結(jié)合的原則，運用現(xiàn)代中藥藥理研究成果，科學(xué)用藥組方。本實驗主要觀察益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀TXL 對糖尿病心肌病大鼠心肌凋亡因子Bnip－3、Bcl－2的影響，初步探討其可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 8周齡清潔級SD 大鼠80只，雌雄各半，體重170～200g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（軍）2012—006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22℃，相對濕度60%～80%，定時通風(fēng)，保持自然光照，動物每日喂普通飼料，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）為美國Sigma 公司產(chǎn)品，批號SL12136。葡萄糖（GLU）、膽固醇（CH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）測定試劑盒均購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；兔抗鼠Bnip－3、Bcl－2多克隆抗體（一抗）、即用型SABC 免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。中藥復(fù)方糖心樂（TXL）制備：將絞股蘭、人參、麥冬、田三七、生石膏等水煎3次，30min／次，將3次濾液收集蒸發(fā)為分別含生藥1g／mL 和2g／mL 的湯劑。格列奇特（商品名達美康）：陜西東盛（集團）有限公司，80mg／片，批號：P2012121214203231。

1.3 儀 器 BS－800全自動生化分析儀、LKD－2188型超薄切片機、JEM－2000EX透射電子顯微鏡。

2 實驗方法

2.1 DMCP動物模型建立與分組 首先隨機各取雌雄SD 大鼠5只作為正常對照組，其余70只大鼠禁食12h后，每只用0.1mol／L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH4.4）配制的0.55%STZ 以55mg／kg一次性腹腔注射，正常對照組腹腔內(nèi)注射等體積枸櫞酸鹽緩沖液［3］。注射1周后采用眼外眥取血測空腹血糖，血糖大于13.8mmol／L為DM 造模成功者［4］，小于13.8mmol／L 共13只剔除。依據(jù)血糖高低排號，隨機選取DM 造模成功大鼠雌雄各24只，隨機分為模型對照組、達美康對照組、TXL 大、小劑量組雌雄各6只，飼養(yǎng)8周后形成DMCP大鼠［5］。在實驗期間各組大鼠攝食普通飼料，正常飲水。

2.2 給藥及方法 DMCP 大鼠形成后開始灌胃治療。TXL大、小劑量組分別予以高濃度（2g／mL）TXL 湯劑14g／kg·d、低濃度（1g／mL）TXL湯劑7g／kg·d灌胃，達美康對照組予以濃度為3mg／mL 混懸液20mg／kg·d 灌胃，連續(xù)給藥4周。正常對照組、模型對照組均予以生理鹽水6.5g／kg·d灌胃。

2.3 指標(biāo)測定 2.3.1 血生化指標(biāo)測定：采用葡萄糖氧化酶法測定GLU，酶法測定CH、TG；直接一步法測定HDL、LDL。

2.3.2 電鏡觀察：在灌胃第4周末，動物用10%水合氯醛腹腔麻醉處死，迅速打開胸腔，取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水充分洗凈心臟血液，切取部分左心室前壁組織，經(jīng)3%的戊二醛固定、常規(guī)PBS漂洗、丙酮梯度脫水、Epon812 包埋、超薄切片機切片、鉛鈾雙重染色后透射電鏡觀察［5］。

2.3.3 免疫組化法測定Bnip－3、Bcl－2：左心室前壁組織剩余部分經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切成4μm 切片，貼附于涂有多聚賴氨酸的玻片備用。Bnip－3、Bcl－2抗體經(jīng)高壓熱修復(fù)，采用免疫組化鏈霉菌抗生素蛋白－過氧化物酶（S－P）法，按試劑盒說明進行操作。光鏡下以心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕色、棕褐色顆粒為Bnip－3、Bcl－2陽性表達。采用Image－Pro Plus分析軟件進行圖像分析，每張切片隨機取5個視野測定陽性產(chǎn)物的積分光密度（IOD），取平局值代表表達強度，IOD 值越大，表示陽性表達越強。

3 實驗結(jié)果

整個實驗過程中大鼠共死亡5只，其中模型對照組2只雄性、1只雌性，TXL大、小劑量組各1 只雄性，達美康對照組和正常對照組均無大鼠死亡。死亡原因可能是血糖過高導(dǎo)致糖尿病酮癥酸中毒、感染和其他糖尿病并發(fā)癥。

3.1 TXL對DCMP大鼠血糖、血脂的影響 見表1。

表1 TXL對DCMP大鼠空腹血糖、血脂的影響（±s，mmol／L）

表1 TXL對DCMP大鼠空腹血糖、血脂的影響（±s，mmol／L）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與模型對照組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01；與達美康對照組比較，□P＜0.05，■P＜0.01

GLU CH TG HDL LDL正常對照組10 6.69±1.27 1.56±0.21 0.77±0.16 1.46±0.20 0組 別n .79±0.11模型對照組9 23.16±5.74▲2.83±0.57▲2.69±0.53▲0.81±0.22▲1.75±0.43▲達美康對照組12 10.54±2.06◆1.85±0.29◆1.11±0.23◆1.21±0.25◆1.04±0.26◆TXL大劑量組11 11.70±2.45◆2.03±0.25◆1.30±0.27◆1.18±0.21◆1.18±0.35◆TXL小劑量組11 16.34±2.92◆■2.44±0.54◇■1.84±0.44◆■1.04±0.23◇■1.31±0.33◇□

治療4周后，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血GLU、CH、TG、LDL水平均明顯升高，HDL 水平明顯下降，均有顯著性差異（P＜0.01）；與模型對照組比較，達美康對照組、TXL大、小劑量組血GLU、CH、TG、LDL 水平均明顯下降，HDL 水平明顯升高，均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）；與達美康對照組比較，TXL 大劑量組血GLU、CH、TG、LDL 水平升高，HDL水平下降，均無顯著性差異（P＞0.05），TXL 小劑量組血GLU、CH、TG、LDL 水平升高，HDL 水平下降，均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。

3.2 TXL對DCMP大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 見圖1～6。

正常對照組大鼠心肌肌絲排列整齊，明暗帶清晰，無肌原纖維斷裂、溶解，線粒體結(jié)構(gòu)完整（圖1）。DMCP模型對照組大鼠心肌肌絲排列紊亂，明暗帶模糊，局部有肌絲斷裂、溶解，線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)不清，肌纖維間出現(xiàn)大量糖原沉積，可見較多脂滴（圖2），并可見鞘樣結(jié)構(gòu)（圖3）。達美康對照組心肌超微結(jié)構(gòu)與模型對照組比較，心肌結(jié)構(gòu)明顯改善，糖原、脂滴沉積減少（圖4）。糖心樂大劑量組肌絲排列基本整齊，明暗帶較清晰，線粒體結(jié)構(gòu)較完整，糖原、脂滴沉積減少（圖5）。糖心樂小劑量組肌絲仍有部分?jǐn)嗔?，糖原、脂滴大量沉積（圖6）。

3.3 TXL對DCMP大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2的影響 見表2。

表2 TXL對DCMP大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2的影響（±s）

表2 TXL對DCMP大鼠心肌Bnip－3、Bcl－2的影響（±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與模型對照組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01；與達美康組對照比較，□P＜0.05，■P＜0.01

組 別n Bnip－3Bcl－2正常對照組模型對照組達美康對照組TXL大劑量組TXL小劑量組10 9 12 11 11 69.37±4.63 95.13±6.11▲73.57±6.32◆77.13±7.93◆85.13±8.06◇■90.91±6.98 70.67±5.23▲88.07±6.79◆85.29±6.53◆79.98±7.06◆□

與正常對照組比較，模型對照組大鼠心肌Bnip－3表達水平均升高，Bcl－2表達水平下降，均有顯著性差異（P＜0.01）；與模型對照組比較，達美康對照組、TXL 大、小劑量組心肌Bnip－3表達水平均下降，Bcl－2表達水平升高，均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）；與達美康對照組比較，TXL 大劑量組心肌Bnip－3表達水平均升高，Bcl－2表達水平下降，均無顯著性差異（P＞0.05），TXL小劑量組心肌Bnip－3表達水平均下降，Bcl－2表達水平升高，均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。

4 討 論

糖尿病心肌病獨立于血管、瓣膜損害所致心肌病，它是由糖尿病狀態(tài)所致的一種心臟疾病，功能上定義為心室擴張，心肌細(xì)胞肥大，顯著心肌間質(zhì)纖維化，舒張功能障礙伴或不伴收縮功能障礙［6］。本實驗用STZ作為糖尿病模型的誘導(dǎo)劑，選擇大鼠作為造模動物是因其胰腺的B 細(xì)胞對STZ的敏感性較強而穩(wěn)定［7］。給藥1周后即可出現(xiàn)穩(wěn)定高血糖狀態(tài)，隨病程8周進展為DCMP模型，經(jīng)模型對照組檢測血糖、血脂生化指標(biāo)及心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察均符合DCMP，表明STZ腹腔注射法造模成功。

細(xì)胞凋亡是有機體由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性死亡過程，又稱細(xì)胞程序性死亡。而且細(xì)胞凋亡過程受多種基因調(diào)控，表現(xiàn)為凋亡信號通路的啟動和相關(guān)基因產(chǎn)物的表達［8］。糖尿病從多個方面損害心肌細(xì)胞，研究證實心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病的重要發(fā)病機制之一。近年來，心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展中的作用已受到重視。目前認(rèn)為Bcl－2家族是心肌細(xì)胞凋亡過程中非常重要的調(diào)節(jié)因子［9］，通過促、抑兩類凋亡基因相互作用調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡。Bcl－2家族蛋白根據(jù)其功能主要分為兩大類：以Bcl－2、Bcl－xL 為代表的抑細(xì)胞凋亡因子；以Bnip－3、Bax等為代表的促細(xì)胞凋亡因子。其中Bcl－2的主要作用是抑制細(xì)胞凋亡和延長細(xì)胞存活時間。多數(shù)研究證實Bcl－2水平升高可抑制caspase活性，降低細(xì)胞色素C 釋放，顯著抑制細(xì)胞凋亡，該抑制可持續(xù)2周左右［10］。Bnip－3是近年來受到關(guān)注的Bcl－2家族中新的促細(xì)胞凋亡因子，可能通過上調(diào)氧化應(yīng)激和線粒體呼吸相關(guān)基因，促進心肌脂肪酸氧化代謝及直接影響線粒體跨膜電勢差等機制，介導(dǎo)高糖心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。亦證明Bnip3參與糖尿病心肌廣泛纖維化和心肌重塑的過程。加之Bnip3參與調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞炎癥因子表達上調(diào)，提示其對糖尿病心肌病發(fā)病的各個環(huán)節(jié)中均有作用。有研究證實［11］，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡增多與心肌促凋亡基因的過度表達以及抑制凋亡基因的下調(diào)有關(guān)。所以Bcl－2、Bnip－3是影響細(xì)胞凋亡的重要因素，是糖尿病心肌損害向糖尿病心肌病發(fā)展的重要節(jié)點蛋白，將作為治療糖尿病心肌病的有效靶點之一。本實驗結(jié)果可以看出，與正常對照組比較，模型對照組大鼠心肌Bcl－2表達明顯減少，Bnip－3表達明顯增多，說明高血糖可引起心肌細(xì)胞Bcl－2 基因表達下調(diào)，Bnip－3 基因表達上調(diào)。大量研究證實，高血糖能直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞凋亡與高血糖引起的活性氧形成及局部腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）激活有關(guān)［12，13］。

中藥復(fù)方TXL通過發(fā)揮中醫(yī)藥治療的多層面、多向性、多靶點的藥理特點，以多種途徑降血糖，從而達到對抗高血糖所致促凋亡因子上調(diào)及抑凋亡因子下調(diào)，同時提高心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶活性，清除自由基，而起到抗氧化作用，減少細(xì)胞凋亡。有研究證明達美康并不刺激活性氧生成，也能減少細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果看出，TXL 和達美康均能有效降低DCMP 大鼠心肌細(xì)胞促凋亡因子Bnip－3的表達，升高心肌細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl－2的表達，而且TXL 作用與劑量有一定相關(guān)性，大劑量和達美康作用相當(dāng)，證明TXL能通過影響B(tài)cl－2、Bnip－3表達有效抑制DCMP大鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而對心肌細(xì)胞起保護作用。

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