海帶多糖純化及清除自由基活性研究

彭臻菲，方哲翔，劉 敏，張其清，*

(1.福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建福州 350108;2.福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院，福建福州 350002)

海帶(Laminaria japonica)，又名昆布、江白菜，屬褐藻，分布于我國(guó)山東、遼寧、浙江、福建等沿海省區(qū)，是一種廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)型海藻。我國(guó)海帶的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量均居世界首位，海帶年產(chǎn)量占世界海帶年產(chǎn)量的90%。其中，福建省海帶養(yǎng)殖產(chǎn)量位居全國(guó)首位［1］。我國(guó)海帶產(chǎn)品主要以初級(jí)加工產(chǎn)品為主，海帶產(chǎn)品平均單價(jià)在600美元/t。而鄰國(guó)日本則注重開(kāi)發(fā)海帶功能保健食品，其海帶產(chǎn)品平均單價(jià)是中國(guó)的3倍［2］。因此，提高海帶產(chǎn)品產(chǎn)值，解決制約海帶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的高產(chǎn)、低值問(wèn)題，是推動(dòng)海帶養(yǎng)殖、生產(chǎn)、銷(xiāo)售良性健康發(fā)展的關(guān)鍵。多糖是海帶主要的生物活性物質(zhì)之一，已有研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖具有抗氧化、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖、抗凝血以及抗腫瘤等方面的活性，預(yù)示著海帶多糖具有開(kāi)發(fā)為藥品或功能保健品的潛能［3－7］。但是，目前海帶多糖生物活性的研究仍不夠系統(tǒng)，很多關(guān)于生物活性的報(bào)道選用的是純度低的海帶多糖，且缺乏結(jié)構(gòu)分析和活性機(jī)制研究。本實(shí)驗(yàn)立足福建海帶的資源優(yōu)勢(shì)，制備純度較高的海帶多糖，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并在體外評(píng)價(jià)其自由基清除活性，為海帶功能性產(chǎn)品的研究與開(kāi)發(fā)提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶多糖 本實(shí)驗(yàn)室制備;S－300凝膠填料、葡聚糖Dextran T系列分子量標(biāo)準(zhǔn)品 均購(gòu)自GE公司;D－木糖、D－半乳糖、D－甘露糖、D－鼠李糖、D－葡萄糖、D－阿拉伯糖、D－巖藻糖 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);D－葡萄糖醛酸 Alfa Aesar公司產(chǎn)品;苯酚、濃硫酸、氯仿、氯化鈉、甲醇、PMP、三氟乙酸 均為國(guó)產(chǎn)分析純;乙腈 國(guó)產(chǎn)色譜純。

DBS自動(dòng)部分收集器、HL2S恒流泵 上海滬西分析儀器有限公司;RE5210A旋轉(zhuǎn)濃縮儀 上海亞榮生化儀器廠;UV1600分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Agilent1100高效液相色譜 美國(guó)安捷倫公司;AFZ1001U超純水系統(tǒng) 艾科浦公司;TP114電子天平 賽多利斯公司;Nexus670紅外光譜儀 賽默飛世爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海帶多糖純化 海帶多糖的制備參考文獻(xiàn)8。海帶干粉經(jīng)水提醇沉及DEAE－A25粗分后，得到海帶多糖粗組分，分別為高、中、低鹽組分，其中低鹽洗脫組分便于后處理，且具有較高的自由基清除活性［8］。取適量海帶多糖低鹽粗組分干粉，溶于去離子水，配成濃度為5mg/mL樣品溶液。經(jīng)S－300凝膠層析分離，去離子水洗脫，流速為3mL/10min，苯酚－硫酸法測(cè)定各管多糖含量，收集合并各洗脫峰峰尖部分，經(jīng)濃縮凍干后即得純化后多糖組分WPS－1－1和 WPS－1－2。

1.2.2 多糖相對(duì)分子量測(cè)定 取純化多糖樣品，溶于去離子水，微孔濾膜過(guò)濾，備用。

色譜條件:色譜柱為T(mén)SK－GEL(G5000 PWXL，7.8×300mm)，檢測(cè)器為ELSD800，流動(dòng)相為去離子水，流速 0.5mL/min，柱溫 30℃，進(jìn)樣量 25μL。

1.2.3 多糖的單糖組成測(cè)定 采用高效液相色譜法分析多糖的單糖組成，具體方法如下:稱(chēng)取純化的多糖樣品，溶于去離子水配制成25mg/mL樣品溶液，量取100μL樣品溶液置安瓿瓶中，加入2mol/L三氟乙酸150μL，封口，110℃水解2h。冷卻至室溫后，加入200μL甲醇，氮?dú)獯蹈桑貜?fù)操作2次，以除去未反應(yīng)的三氟乙酸。加入超純水溶解水解物后，加入0.6mol/L氫氧化鈉溶液和0.4mol/L PMP－甲醇溶液，混勻后，于70℃水浴100min，冷卻至室溫，0.3mol/L鹽酸中和后，氯仿萃取，取水相進(jìn)行液相色譜分析。

色譜條件:色譜柱為C18柱(Waters Cosmosil C18，4.6 ×250mm i.d.，5μm)，流動(dòng)相為0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.7)－乙腈(83∶17)，流速 1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

1.2.4 多糖紅外光譜測(cè)定 取純化多糖樣品5mg，KBr研磨壓片后，在4000～500cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.2.5 多糖清除自由基活性測(cè)定

式中:Ai為樣品組吸光值;A0為對(duì)照組吸光值。

1.2.5.2 羥自由基(·OH)清除能力測(cè)定 利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH。分別于試管中加入 Tris－HCl緩沖液 1.0mL、番紅溶液 1.0mL、蒸餾水 1.0mL、EDTANa2－Fe2+溶液 0.5mL、多糖樣品溶液 0.5mL和H2O2溶液0.5mL，混勻，37℃水浴保溫30min，冷卻至室溫后于520nm處測(cè)定吸光度。對(duì)照組以0.5mL蒸餾水代替待測(cè)多糖樣品，空白組以1mL蒸餾水代替待測(cè)多糖樣品和EDTANa2－Fe2+溶液。計(jì)算海帶多糖對(duì)·OH清除率公式:

式中:ASample為加入樣品后的吸光值;A0為對(duì)照組的吸光值;A為空白組的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 海帶多糖純化

海帶多糖低鹽粗組分的純化結(jié)果見(jiàn)圖1。海帶多糖粗組分經(jīng)S－300層析分離后得到兩個(gè)洗脫峰，分別命名為WPS－1－1和 WPS－1－2。其中，多糖洗脫峰WPS－1－1為主要洗脫組分。分別收集兩個(gè)洗脫峰峰尖部分，經(jīng)濃縮、凍干，計(jì)算多糖洗脫組分WPS－1－1和 WPS－1－2 得率分別為 40%和 16.2%。初步測(cè)定1mg/mL濃度下WPS－1－1和WPS－1－2兩個(gè)洗脫組分對(duì)·OH清除活性，發(fā)現(xiàn)WPS－1－1對(duì)·OH清除率是 WPS－1－2的 2.5 倍。因此，選擇 WPS－1－1組分進(jìn)行多糖結(jié)構(gòu)分析和自由基清除活性研究。

圖1 海帶多糖S－300洗脫曲線Fig.1 Elusion curve of Laminaria japonica polysaccharide on S－300 chromatography

2.2 多糖純度鑒定

多糖純度指的是相似鏈長(zhǎng)多糖分子的平均分布。通常需要采用至少2種方法進(jìn)行多糖純度鑒定。本實(shí)驗(yàn)分別采用高效液色譜法和瓊脂糖凝膠電泳法鑒定多糖純度。

由圖2可知，多糖組分WPS－1－1經(jīng)高效液相色譜分離后呈單一的對(duì)稱(chēng)峰，表明WPS－1－1為均一多糖組分。

圖2 WPS－1－1高效液相色譜分析Fig.2 HPLC analysis of WPS－1－1

由圖3可知，多糖組分WPS－1－1經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示其呈單一斑點(diǎn)，表明WPS－1－1為均一多糖組分。因此，高效液相色譜和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果均表明，WPS－1－1為均一的多糖組分。

表1 WPS－1－1 單糖組成(%)Table1 Monosaccharide composition of WPS－1－1(%)

圖3 WPS－1－1瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.3 Electrophoresis of WPS－1－1 on a garose gel

2.3 多糖相對(duì)分子量測(cè)定

取已知分子量的Dextran T系列標(biāo)準(zhǔn)品(分子量分別為10、70、150、500ku)進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄各分子量標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。以標(biāo)準(zhǔn)品柱內(nèi)保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸得其方程為:y=－0.2778x+9.2743(R2=0.9962)，其中，y為分子量Mw對(duì)數(shù)值lgMw，x為保留時(shí)間(min)。將測(cè)得的 WPS－1－1柱內(nèi)保留時(shí)間為15.207min，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得其相對(duì)分子量為112ku。

2.4 多糖的單糖組成測(cè)定

海帶多糖純化組分WPS－1－1經(jīng)酸解、PMP衍生化后，采用高效液相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)表1。與標(biāo)準(zhǔn)單糖保留時(shí)間比對(duì)，海帶多糖純化組分WPS－1－1含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖、巖藻糖等單糖。其中，巖藻糖、木糖、半乳糖、甘露糖為主要單糖組分，其摩爾比為 6.9∶3.3∶1.5∶1。

2.5 多糖紅外光譜分析

海帶多糖純化組分WPS－1－1紅外掃描圖譜見(jiàn)圖4。紅外分析結(jié)果顯示，多糖純化組分WPS－1－1具有多糖類(lèi)物質(zhì)的特征吸收峰。在3350～3390cm－1之間出現(xiàn)一個(gè)寬峰，是糖分子內(nèi)或分子間氫鍵伸縮振動(dòng)結(jié)果;2935cm－1附近較弱的肩峰是C－H伸縮振動(dòng)引起的;1648cm－1的吸收峰為C=O不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng);1410～1420cm－1之間吸收峰是C－H的變角振動(dòng);1245～1255cm－1吸收峰與S=O伸縮振動(dòng)有關(guān)，提示硫酸酯基的存在;1000～1200cm－1間的吸收峰是吡喃糖環(huán)的醚鍵和羥基的吸收峰［9］。895cm－1處吸收峰是吡喃糖β－型C－H變角振動(dòng)，提示W(wǎng)PS－1－1組分含有β－糖苷鍵。

2.6 多糖清除自由基活性測(cè)定

圖4 WPS－1－1紅外光譜分析Fig.4 FT－IR spectra of WPS－1－1

本實(shí)驗(yàn)體外評(píng)價(jià)了海帶多糖純化組分WPS－1－1的自由基清除活性。由圖5a可知，WPS－1－1對(duì)清除率與多糖濃度呈正相關(guān)。在濃度為0.1mg/mL時(shí)，其對(duì)清除率為18%，當(dāng)濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，其對(duì)·清除率達(dá)到91.7%，與相同濃度下 VC對(duì)清除率相當(dāng)。WPS－1－1對(duì)·OH 清除活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5b。隨著 WPS－1－1作用濃度的增大，其對(duì)·OH清除活性逐漸增強(qiáng)。當(dāng) WPS－1－1濃度為0.5mg/mL時(shí)，WPS－1－1 對(duì)·OH 清除為30%，當(dāng)濃度上升至3mg/mL時(shí)，其·OH清除率達(dá)到92%。前期實(shí)驗(yàn)已證明海帶多糖低鹽粗組分具有自由基清除活性，其對(duì)和·OH的最大清除率分別為70%和80%［8］。由此可見(jiàn)，隨著海帶多糖純度的提高，多糖的自由基清除活性逐漸增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得WPS－1－1對(duì)和·OH的IC50分別為0.35和1.0mg/mL，而 VC對(duì)的IC50則小于0.1mg/mL，對(duì)·OH 的 IC50為 1.81mg/mL。

海藻多糖構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果表明，多糖的分子量、硫酸根含量、糖醛酸含量和巖藻糖含量等都與其自由基清除活性有關(guān)［14－16］。其中，巖藻糖是海藻多糖主要的結(jié)構(gòu)組成。研究發(fā)現(xiàn)，巖藻糖含量越高的海藻多糖，其自由基清除活性越強(qiáng)［17］。由單糖組成分析結(jié)果可知，海帶多糖純化組分WPS－1－1主要由巖藻糖、木糖、半乳糖和甘露糖組成，其中巖藻糖含量達(dá)到50%，表明WPS－1－1巖藻糖含量可能是影響其自由基清除活性的主要因素之一。此外，紅外光譜分析結(jié)果顯示，WPS－1－1還含有活性基團(tuán)硫酸基，但其對(duì)WPS－1－1自由基清除活性的影響仍有待于進(jìn)一步研究。

圖5 WPS－1－1自由基清除活性Fig.5 Scavenging effects on free radicals of WPS－1－1

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)純化獲得的多糖組分WPS－1－1是分子量為112ku的雜多糖，主要由巖藻糖、木糖、半乳糖和甘露糖組成，其摩爾比為 6.9∶3.3∶1.5∶1。紅外光譜分析結(jié)果表明，WPS－1－1含有硫酸基，并以β－吡喃糖苷鍵為主要鍵型。體外清除自由基活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，WPS－1－1 對(duì)和·OH均有較好的清除活性，尤其是對(duì)·OH清除活性尤為顯著。海帶多糖純化組分WPS－1－1是天然活性多糖，具有良好的生物相容性，其顯著的清除自由基活性使其成為功能性自由基清除劑開(kāi)發(fā)的優(yōu)質(zhì)資源。

［1］農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.中國(guó)漁業(yè)年鑒［M］.2008:230.

［2］程艷，陳麗嬌，肖欣欣，等.國(guó)內(nèi)外海帶加工現(xiàn)狀與福建省的發(fā)展對(duì)策［J］.福建水產(chǎn)，2011，33(2):89－92.

［3］閻俊，羅瓊，楊明亮，等.海帶多糖抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用的研究［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(3):219－221.

［4］李春梅，高永林，李敏，等.海帶多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血脂鵪鶉的降脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［J］.中藥材，2005，28(8):676－679.

［5］X Zhao，S Dong，J Wang，et al.A comparative study of antithrombotic and antiplatelet activities of different fucoidans from Laminaria japonica［J］.Thrombosis Research，2012，129:771－778.

［6］L Yu，Y Q Ding，L Liang，et al.Inhibition of growth and metastasis of human colorectal carcinoma cells by laminarin［J］.Chin J Clin Rehabil，2003，7(26):3588－3589.

［7］王庭欣，趙文，蔣東升，等.海帶多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，23(2):137－139.

［8］Z Peng，M Liu，Z Fang，et al.In vitro antioxidant effects and cytotoxicity of polysaccharides extracted from Laminaria japonica［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，50:1254－1259.

［9］M Kaeurakova，P CaPek，V Sasinkova，et al.FT－IR study of Plant cell wall model compounds Peetic Polysaeeharides and hemceelluloses［J］.Carbohydrate Polymers，2000，43:195－203.

［10］王云海，羅云敬，鐘儒剛.過(guò)氧亞硝酸根對(duì)蛋白質(zhì)損傷的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)進(jìn)展，2007，19(6):893－901.

［11］H M Shen，C F Yang，W X Ding，et al.Superoxide radicalinitiated apoptotic signaling pathway in selenite－treated HepG2 cells:mitochonaria serve as the main target［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2001，30(1):9－21.

［12］樓蘭花，駱紅梅.羥自由基誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷時(shí)ATP酶等變化［J］.中國(guó)心血管雜志，2003，8(6):393－397.

［13］G D Smoluk，R C Fahey，J F Ward，et al.Interaction of glutathione and other low－molecular weight thiols with DNA:Evidence for counter ion condensation and colon depletion near DNA［J］.Radiat.Res.1998，114:3－10.

［14］H Qi，T Zhao，Q Zhang，et al.Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm(Chlorophyta)［J］.Journal of Applied Phycology，2005，17:527－534.

［15］X Zhao，C H Xue，B F Li.Study of antioxidant activities of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica［J］.Journal of Applied Phycology，2008，20:431－436.

［16］劉承穎，王維民.半葉馬尾藻中巖藻聚糖硫酸酯的提取純化及抗氧化研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29(11):71－75.

［17］薛長(zhǎng)湖，陳磊，李兆杰，等.巖藻聚糖硫酸酯體外抗氧化特性的研究［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，30(4):583－588.