三七總皂苷對(duì)急性肺損傷大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液腫瘤壞死因子α、白介素6和白介素10水平的影響

陳宇清，榮 令，周 新

多發(fā)性創(chuàng)傷和嚴(yán)重感染?？梢鸺毙苑螕p傷 (acute lung injury，ALI)甚至急性呼吸窘迫綜合征 (acute respiratory distress syndrome，ARDS)。目前認(rèn)為ALI/ARDS是由多種炎性遞質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與，并呈級(jí)聯(lián)放大的瀑布樣炎癥與繼發(fā)性彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷。ALI時(shí)肺毛細(xì)血管通透性增加，富含蛋白的水腫液進(jìn)入肺間質(zhì)甚至肺泡，導(dǎo)致嚴(yán)重通氣/血流比例失調(diào)，繼而造成頑固性低氧血癥。在參與炎癥反應(yīng)與肺損傷中的眾多炎癥遞質(zhì)中，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)是最有影響的促炎癥細(xì)胞因子，其與ALI的發(fā)病和死亡率密切相關(guān)［1-2］。三七總皂苷 (saponins of panax notoginseng，PNS)是五加科人參屬植物三七的提取物，能阻斷受體操縱性鈣通道、增強(qiáng)一氧化氮 (NO)的擴(kuò)張血管作用、改善微循環(huán)以及抗缺血再灌注損傷，對(duì)心、肝、腎、腦及腸黏膜屏障等均具有良好的抗損傷作用［3-5］。本研究采用油酸-脂多糖序貫誘導(dǎo)急性肺損傷 (OA-ALI)大鼠模型，觀察PNS對(duì)OA-ALI大鼠氧合能力、肺含水量與病理學(xué)變化的影響，以及對(duì)血清與支氣管肺泡灌洗液 (BALF)中TNF-α、IL-6和IL-10水平的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 Wistar雄性健康大鼠28只，體質(zhì)量250～300g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 (證書號(hào) No.283)。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周，清潔級(jí)恒溫 (25℃)環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由取水。油酸 (oleic acid，OA)和脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)由美國(guó)Sigma公司提供，TNF-α、IL-6和IL-10試劑盒均由上海越研生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法 按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為4組，每組7只。A組為正常對(duì)照組，B組為ALI模型對(duì)照組，C組為ALI模型+PNS治療組，D組為ALI模型+PNS治療+機(jī)械通氣組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用10%水合氯醛 (0.35ml/kg)腹腔注射麻醉，肝素(400U/kg)腹腔注射抗凝，B、C和D組動(dòng)物下腔靜脈置管緩慢注射OA 0.2ml/kg，再給予0.9%氯化鈉溶液0.08ml尾靜脈注射，4h后給予LPS(4mg/ml)5mg/kg腹腔注射。經(jīng)腹主動(dòng)脈采血0.3～0.5ml測(cè)定動(dòng)脈血?dú)?。?dòng)脈血氧分壓/吸入氧濃度(PaO2/FiO2)≤300mmHg(1mmHg=0.133kPa) 時(shí)認(rèn)為ALI模型建立成功。D組大鼠氣管插管后與ALC-V8型動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司，上海)連接。機(jī)械通氣參數(shù)設(shè)置:通氣模式為控制通氣 (controlled mandatory ventilation，CMV)，潮氣量 (VT):15ml/kg，通氣頻率:40次/min，吸呼時(shí)間比:1∶1，呼氣末正壓 (PEEP):0 cm H2O(1cmH2O=0.098 kPa)，吸入氧濃度 (FiO2):21%。C、D兩組動(dòng)物尾靜脈注射PNS 100mg/kg(云南植物藥業(yè)有限公司提供);B組則予以等體積0.9%氯化鈉溶液代替。

1.3 BALF的采集、病理學(xué)檢查 建模成功后4h用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鉀處死動(dòng)物，處死動(dòng)物前留取動(dòng)脈血1～2ml，枸櫞酸鈉抗凝。打開胸腔后夾閉雙側(cè)肺門，以手術(shù)線分別結(jié)扎左右主支氣管，取套針扎入左主支氣管近端，以4℃無菌肝素鹽水 (200U/ml)15ml，分3次灌入左肺，每次盥洗2遍，最終回收到 BALF 12～13ml。將 BALF 1000r/min離心10min，13000×g離心30min后備用。于遠(yuǎn)離結(jié)扎處剪下右肺，上葉置于10%中性甲醛中固定48h后常規(guī)制備石蠟切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅 (HE)和維多利亞藍(lán)-立春紅 (VP)染色。游離左肺，迅速用吸水紙吸干表面水分和血液，電子天平精確稱濕質(zhì)量 (wet weight，W)，經(jīng) -0.06kPa×70℃脫水 24h后，再稱量干質(zhì)量 (dry weight，D)，以肺W/D比值表示肺組織含水量。

1.4 酶聯(lián)免疫 (ELISA)法檢測(cè) TNF-α、IL-6和IL-10操作流程 (雙抗體夾心法)依照試劑明書。終止反應(yīng)后，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀槽內(nèi)，選擇450nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，確定標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照區(qū)域，由酶標(biāo)檢測(cè)檢測(cè)計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，打印全部樣本檢測(cè)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，組間比較采用Bonfferoni t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理 A組大鼠肺呈均勻淡粉紅色，包膜完整，彈性好，表面未見病損灶，無液體溢出;光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔均勻一致，肺泡腔清晰，肺泡壁光滑，僅可見少量粒細(xì)胞;B組大鼠的肺臟體積顯著增大，充血水腫明顯，彈性降低;光鏡下可見肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)出血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增寬，伴有灶性肺不張;注射PNS后C、D兩組大鼠的肺組織病理損傷較B組減輕 (見圖1)。

圖1 ALI大鼠的肺組織病理改變Figure 1 Change of ALI in rat lung tissue pathologic

2.2 肺組織W/D與氧合的比較 4組大鼠動(dòng)脈血二氧化碳分壓 (PaCO2)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。OA-LPS序貫注射后B組、C組和D組3組大鼠的PaO2/FiO2均≤300mmHg，4組PaO2/FiO2、W/D比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。C、D組大鼠PaO2/FiO2與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);B組與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。B組大鼠的肺W/D值較A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);PNS注射后C、D兩組大鼠的W/D值與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見表1)。

2.3 血清、BALF的TNF-α、IL-6和IL-10水平的比較4組大鼠血清、BALF的TNF-α、IL-6和IL-10水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。B組大鼠血清 TNF-α、IL-6和IL-10水平與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t值分別為 -27.815、 -27.559、 -49.731，P ＜0.01);B 組大鼠BALF中的TNF-α、IL-6和IL-10水平與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t值分別為 -34.407、-40.261、 -19.410，P＜0.01);B組大鼠BALF中的TNF-α、IL-6和IL-10水平與血清比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。C、D兩組大鼠在注射PNS后其血清TNF-α、IL-6和IL-10水平與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);C、D兩組大鼠BALF中的TNF-α、IL-6和IL-10水平與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);C、D兩組大鼠BALF中的IL-6水平與血清IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。正壓機(jī)械通氣支持30min后，D組大鼠血清與BALF中的TNF-α、IL-6和IL-10水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

表1 4組大鼠的PaO2/FiO2、PaCO2、W/D的比較(±s)Table 1 Comparison of PaO2/FiO2，PaCO2，W/D in the 4 groups of rats

表1 4組大鼠的PaO2/FiO2、PaCO2、W/D的比較(±s)Table 1 Comparison of PaO2/FiO2，PaCO2，W/D in the 4 groups of rats

注:與A組比較，△P＜0.01; 與B組比較，*P＜0.01

組別 只數(shù) PaO2/FiO2(mmHg)PaCO2(mmHg)W/D A組7 440.4 ±33.2 39.5 ±2.6 4.90 ±0.70 B 組 7 249.8 ±24.8△ 38.7 ±2.6 7.65 ±0.55△C 組 7 288.4 ±17.4* 39.4 ±1.3 7.25 ±0.44*D 組 7 291.0 ±22.6* 38.9 ±2.4 7.03 ±0.65*F 178.10 0.427 31.991 P值值＜0.001 ＞0.5 ＜0.001

表2 4組大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-6和IL-10水平比較(±s，ng/L)Table 2 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 levels in serum and BALF in the 4 groups of rats

表2 4組大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-6和IL-10水平比較(±s，ng/L)Table 2 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 levels in serum and BALF in the 4 groups of rats

注:與A組比較，△P＜0.01; 與B組比較，*P＜0.01

BALF組別 只數(shù) TNF-α血清中A 組 7 56.3±6.7 55.4±8.9 48.9±3.8 37.7±3.5 25.2±2.5 22.1±1.8 B組 7 147.5±8.6△ 139.7±6.5△ 137.5±6.7△ 141.5±5.5△ 72.4±2.9△ 64.0±4.5△C 組 7 119.1±7.6* 116.5±6.1* 106.5±4.5* 98.5±4.4* 53.8±2.7* 49.3±3.5*D 組 7 114.7±7.9* 108.9±8.0* 107.1±4.7* 98.3±2.6* 53.9±2.7* 48.6±4.7*F 300.840 159.740 376.003 738.728 365.408 162.206 P值值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 BALF IL-6血清中BALF IL-10血清中

3 討論

目前建立ALI動(dòng)物模型的方法主要有OA、LPS和大劑量0.9%氯化鈉溶液肺泡灌洗3種，OA序貫小劑量LPS造模旨在模擬在嚴(yán)重創(chuàng)傷基礎(chǔ)上并發(fā)重度感染所致ALI，且尤其適用于表現(xiàn)ALI向ARDS演變的過程。本研究顯示應(yīng)用OA-LPS二次致傷后，大鼠出現(xiàn)明顯呼吸窘迫癥狀，氧合 (PaO2/FiO2)顯著惡化;肺組織充血水腫明顯，有較嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。PNS注射后，ALI大鼠的肺組織充血水腫程度明顯減輕，肺W/D 值由 (7.65±0.55) 降至 (7.25 ±0.44)，有顯著性差異，而PaO2/FiO2也得到顯著改善。

炎癥細(xì)胞與炎性遞質(zhì)是ALI形成的重要遞質(zhì)。有研究顯示，TNF-α、IL-6在ALI/ARDS的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，并反映了肺損傷的嚴(yán)重程度。TNF-α是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要環(huán)節(jié)，ALI/ARDS發(fā)生后，血清TNF-α水平早期即出現(xiàn)增高并迅速達(dá)到峰值。TNF-α對(duì)肺有強(qiáng)烈的毒性，能誘導(dǎo)肺內(nèi)皮細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移、中性粒細(xì)胞脫顆粒和毛細(xì)血管滲漏，肺泡內(nèi)積聚的水腫液進(jìn)一步阻礙肺泡細(xì)胞的血流灌注和氧氣交換，加重低氧血癥。TNF-α亦可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-6。IL-6也是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)急性期炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，促進(jìn)多種細(xì)胞的分化、活化，激活T細(xì)胞、B細(xì)胞而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在ALI/ARDS中，IL-6具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)白細(xì)胞聚集、滲透，介導(dǎo)組織損害，加重肺損傷的作用。IL-6水平的增高反過來又可增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì) TNF-α的敏感性［6-7］。本研究中，經(jīng)過OA-LPS二次致傷后，ALI大鼠血清和BALF中的TNF-α和IL-6水平均較正常對(duì)照組顯著增高，PNS注射后，血清和BALF中的TNF-α和IL-6水平則呈顯著降低，表明PNS有助于減輕肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)，抑制促炎癥細(xì)胞因子的釋放，對(duì)肺臟具有一定的保護(hù)作用。PNS聯(lián)合正壓機(jī)械通氣支持組大鼠的血清與BALF中的TNF-α和IL-6水平雖較單獨(dú)注射PNS時(shí)有所改變，但無差異。

IL-10是主要的免疫抑制性細(xì)胞因子。IL-10由多種細(xì)胞產(chǎn)生，其中以Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD+8T細(xì)胞為主，具有廣泛的抑制促炎癥細(xì)胞因子的作用。IL-10可能是通過直接抑制T細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子、抑制抗原提呈細(xì)胞間接抑制T細(xì)胞應(yīng)答、抑制氣道炎癥，最終減輕ALI的發(fā)生發(fā)展。孫榮青等［8］發(fā)現(xiàn)IL-10水平與膿毒癥嚴(yán)重程度相關(guān)，且隨著疾病進(jìn)展IL-10對(duì)炎癥反應(yīng)起到抑制作用。Li等［9］對(duì)42例MODS患者動(dòng)態(tài)檢測(cè)TNF-α、IL-6及IL-10水平的變化，結(jié)果顯示3種炎癥細(xì)胞因子在疾病早期均明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究發(fā)現(xiàn)，PNS不僅能夠抑制樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生TNF-α等炎癥細(xì)胞因子，并對(duì)炎癥造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［10-11］。本研究顯示，OALPS序貫誘導(dǎo)ALI大鼠的血清與BALF中的IL-10水平也較NS對(duì)照組顯著增高，表明在ALI病程中，機(jī)體可能同時(shí)存在促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)，二者平衡的失調(diào)是導(dǎo)致ALI加重并發(fā)展為ARDS的重要機(jī)制之一。PNS具有較強(qiáng)的抗炎作用，在本研究中PNS不僅能夠降低OA-LPS誘導(dǎo)ALI大鼠肺組織中TNF-α和IL-6水平，同時(shí)IL-10的水平也得到顯著降低，顯示PNS在減輕肺組織的炎癥反應(yīng)的同時(shí)，也可能有助于糾正促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)的失衡，減緩或阻止ALI向ARDS的發(fā)展。

OA-LPS誘導(dǎo)ALI后，大鼠體內(nèi)同時(shí)存在促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)，PNS對(duì)其具有一定保護(hù)作用，可以明顯減低ALI大鼠的血清和BALF中的TNF-α、IL-6及IL-10水平，可能有助于減緩或阻止ALI向ARDS發(fā)展。同時(shí)，PNS通過促進(jìn)肺泡內(nèi)液體的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，降低血管外肺水含量，減輕肺水腫，從而改善肺順應(yīng)性，緩解低氧血癥［12］。血清和 BALF中TNF-α、IL-6及IL-10水平的動(dòng)態(tài)變化對(duì)ALI/ARDS的進(jìn)展具有重要的診斷參考價(jià)值。早期干預(yù)炎癥反應(yīng)可能有助于改善ALI的預(yù)后。

1 Waage A，Brandtzaeg P，Halstensen A，et al.The complex pattern of cytokines in derum from patients with meningococcal septic shock.Association between interleukin 6，interleukin 1，and fatal outcome［J］.J Exp Med，1989，169(1):333-338.

2 Steinhauser M，Hogaboam C，Kunkel S，et al.IL-10 is a major mediator of sepsis-induced impairment in lung antibacterial host defense［J］.J Immumol，1999，162:392-399.

3 Ng TB.Pharmacological activity of sanchi ginseng(Panax notoginseng)［J］.J Pharm Pharmacol，2006，58(8):1007-1019.

4 魏宏建，付春來，榮令.三七總皂苷對(duì)腸黏膜屏障保護(hù)作用的研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2006，13(5):309-312.

5 黃侃，鄧祥堅(jiān)，羅健東，等.三七皂甙增強(qiáng)一氧化氮介導(dǎo)的慢性缺氧大鼠肺動(dòng)脈舒張作用［J］.廣州醫(yī)藥，1999，30(4):54.

6 Fattori E，Cappelletti M，Costa P，et al.Defective inflammatory response in interleukin 6-deficient mice［J］.J Exp Med，1994，180(4):1243-1250.

7 Bauer TT，Monton C，Torres A，et al.Comparison of systemic cytokine levels in patients with acute respiratory distress syndrome，severe pneumonia，and controls［J］.Thorax，2000，55(1):46-52.

8 孫榮青，張少雷.膿毒癥早期血清白細(xì)胞介素-18和10在疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值研究 ［J］.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2011，23(5):299-301.

9 Li YH，Jiang XQ，Sun HZ，et al.IL-6，IL-10 and TNF-α in acute organophosphorus pesticide poisoning induced MODS role and clinical significance［J］.Critical Care Medicine，2006，26(11):804-805.

10 Wang Y，Peng D，Huang W，et al.Mechanism of altered TNF-alpha expression by macrophage and the modulatory effect of Panax notoginseng saponins in scald mice ［J］.Burns，2006，32(7):846-852.

11 陳劍鴻，王碧江，劉松青，等.三七總皂苷對(duì)內(nèi)毒素?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥特性的影響 ［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24(3):140-141.

12 陳宇清，榮令，周新.三七總皂甙對(duì)急性肺損傷犬血管外肺水及呼吸力學(xué)的影響 ［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15(6):350-352.