超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和豬尿中的苯乙醇胺A

盧艷芬

(長沙市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心 湖南長沙 410013)

1 前言

苯乙醇胺A又稱為克侖巴胺，化學(xué)名稱為2－4－(4－硝基苯基)丁基－2－基氨基－1－甲氧基苯乙醇，是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)。苯乙醇胺A是福莫特羅的同分異構(gòu)體，是美國禮來公司合成萊克多巴胺時產(chǎn)生的副產(chǎn)物，具有同克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇等藥物相同的作用和效果，屬于β－受體激動劑。苯乙醇胺A同樣具有營養(yǎng)再分配作用［1］，可以用于刺激動物生長，加強蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)沉積，提高基礎(chǔ)代謝水平，使體脂趨于分解，促進生豬長速加快，提高瘦肉率［2］。而人吃了含這種藥物的豬肉后，可出現(xiàn)惡心、頭暈、四肢無力、手顫等中毒癥狀，特別是對心臟病、高血壓患者危害更大［3］。2010年12月農(nóng)業(yè)部公告禁止在飼料和動物飲用水中添加該物質(zhì)［4］。

目前，關(guān)于動物源性食品中β2－受體激動劑類藥物殘留檢測的報道較多［5－8］，但關(guān)于苯乙醇胺A在動物源性食品及動物尿液中檢測方法的研究非常少［9，10］。孫志文等利用酶解16h后反萃再過SPE小柱的處理方法，經(jīng)液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測豬肌肉中的苯乙醇胺A［11］。本文對豬尿和豬肉中苯乙醇胺A的酶解、固相萃取等提取方法和色譜質(zhì)譜測定進行了系列研究，設(shè)計出了快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的苯乙醇胺A超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

UPLC－MS/MS：waters公司TQD系列;離心機：湘儀H－1650型;固相萃取裝置：Alltech;pH計：雷磁PHSJ－4A型;渦旋混勻器：德國IKA，MS3型;振蕩器：蘇州威爾 SHA－C型;超聲儀：昆山 KQ－500DE型;氮氣吹干儀：美國N－EVAPTM112型;固相萃取柱：waters公司MCX，60mg/3mL。

2.1.2 試劑

苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品 (多倫多化學(xué)研究公司);甲醇(色譜純，Merck);高氯酸(分析純);β－鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(Merck);乙酸銨(色譜純，TEDIA);甲酸(色譜純);氨水(分析純);乙酸(分析純);鹽酸(分析純)。

2.2 方法

2.2.1 液相色譜參考條件

色譜柱：BEH C18(50*2.1mm，1.7μm);流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇溶液;梯度洗脫：0 －3.4min 維持 95.0%A，3.4 －3.6min 為95%A 變化至72%A，3.6 －5.5min 維持72%A，5.5－5.7min為72%A 變化至 30%A，5.7 －6.7min維持30%A，6.7－8min為30%A變化至95%A。流速：0.3mL/min;柱溫：35℃;進樣量：4μL。

2.2.2 質(zhì)譜參考條件

電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)檢測;電離電壓：3.0kV;源溫：120℃;霧化溫度：350℃;錐孔氣流速：50L/h;霧化氣流速：580L/h。苯乙醇胺A的檢測條件如表1。

表1 苯乙醇胺A最優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)

2.2.3 樣品前處理

2.2.3.1 豬肉樣品

酶解：準(zhǔn)確稱取2g樣品于50mL離心管里，加入0.2mol/L 乙酸銨緩沖溶液(pH=5.2)8.0mL，加入β－鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL，渦旋混勻，于52℃下避光水浴震蕩反應(yīng)2 h。提取：酶解后放置至室溫，用高氯酸調(diào)pH至1，渦旋混勻，于80℃水浴中超聲30min，11000r/min高速離心10min，傾出上清液于另一50mL離心管里，加入0.1mol/L高氯酸溶液4mL于殘渣中，渦旋并超聲10min后11000r/min高速離心10min。合并上清液，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4，待用。

凈化：MCX小柱依次用3mL甲醇，3mL水活化，取備用液的1/2過柱，再依次用3mL 0.1mol/L高氯酸溶液，3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL 5%氨化甲醇洗脫。洗脫液在40℃下用氮氣吹干，用甲醇+0.1%甲酸溶液(5+95)1mL溶解，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀用。

2.2.3.2 豬尿樣品

準(zhǔn)確移取2mL尿樣于50mL離心管中，加入2mol/L 乙酸銨溶液(pH=5.2)200μL，用乙酸調(diào)pH至5.2，加入40μLβ － 鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，52℃下水浴振蕩器中反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后11000r/min離心10min，取上清液全部過MCX固相萃取小柱。MCX柱依次用3mL甲醇、3 mL水對柱子進行活化，依次用3mL 2%甲酸溶液、3mL甲醇淋洗，用3mL 5%氨化甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，在45℃下氮氣吹干，加入甲醇+0.1%的甲酸溶液 (5+95)2mL溶解殘渣，過0.22μm濾膜后待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理條件的優(yōu)化

β－興奮劑依據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為苯胺型(典型化合物如克倫特羅)和苯酚型(典型化合物如萊克多巴胺)兩大類。苯乙醇胺A屬于苯酚型結(jié)構(gòu)，為中等極性的疏水性化合物，易溶于酸性溶液、堿性溶液、甲醇、乙酸乙酯等極性溶劑。因此，設(shè)計殘留分析時，多以酸性混合有機溶劑為提取液進行提取。

苯酚型激動劑在動物機體的代謝以軛合態(tài)存在，故其殘留檢測必須要經(jīng)過水解過程。通常的水解方法有酸解［12，13］、堿解［14］和酶解［15，16］等，而對于豬肉和豬尿，通常采用酸解和酶解兩種方法。考慮到酸解成本低，反應(yīng)后的雜質(zhì)少等特點，我們在設(shè)計提取方案時，首先考慮的是酸解提取?？疾炝瞬煌乃峤鉂舛?0.2、0.5、1、2mol/L 等 )和不同酸解溫度(60、80℃)下的提取條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對于苯酚型的受體激動劑如沙丁胺醇、萊克多巴胺等，由于其高軛合率，酸解不能將其全部游離出來，致使目標(biāo)化合物回收率低，無法滿足檢測要求。因此，改用酶解方法進行提取。在現(xiàn)有的文獻資料中，β－興奮劑的酶解一般都需要反應(yīng)12－16h［17］。這樣長時間的酶解不適用于實際工作中的快速監(jiān)測。為此，本文對β－興奮劑類化合物的酶解條件進行了研究，以期找到合適的酶解條件。苯乙醇胺A與沙丁胺醇和萊克多巴胺都屬于苯酚型。由于實際工作中沒有苯乙醇胺A的陽性樣品，故以沙丁胺醇陽性豬尿為考察對象，研究了52℃下豬尿中沙丁胺醇的酶解時間(1－16h)與酶解效率的關(guān)系，以及與傳統(tǒng)37℃16h酶解方法的比較。結(jié)果見表2。從表2中可以看出，在52℃下 ，酶解2h時，豬尿中沙丁胺醇的酶解濃度已經(jīng)達到了峰值，且與37℃16h酶解條件下的峰面積值相當(dāng)。在改變酶解溫度的同時，還增加了高氯酸沉降蛋白、80℃高溫滅活及超聲提取等步驟，以進一步提高回收率。

表2 不同酶解條件下豬尿中的沙丁胺醇峰面積

3.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)苯乙醇胺A的化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，選取BEH C18(50*2.1mm，1.7μm)色譜柱進行分析。此外，在流動相中加入適量的甲酸以增加其檢測的靈敏度，在合適的條件下，苯乙醇胺A在6.12 min左右出峰，總運行時間為8min，保證了在樣品中雜質(zhì)組分與目標(biāo)化合物的有效分離，從而減少了基質(zhì)的干擾和抑制作用。此外，為增加測試的準(zhǔn)確度，本實驗采用空白基質(zhì)加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

為獲得較高靈敏度的檢測結(jié)果和消除基質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)的抑制作用，在本實驗中采用空白基質(zhì)加苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)溶液進行調(diào)諧，選取最優(yōu)的毛細管電壓、碰撞能等參數(shù)，其結(jié)果見表1。苯乙醇胺A的二級質(zhì)譜圖和提取離子多反應(yīng)監(jiān)測圖見圖1和圖2。

圖1 苯乙醇胺A的二級質(zhì)譜圖

圖2 苯乙醇胺A的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

3.3 方法的線性關(guān)系和測定限

3.3.1 方法的線性關(guān)系

用甲醇+0.1%甲酸水(5+95)配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：0.2、1、2、5、10、20、50μg/L。在確定的實驗條件下進樣分析，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其結(jié)果見圖3。從圖中可以看出在0.2μg/L －50μg/L的濃度范圍內(nèi)，苯乙醇胺A相關(guān)系數(shù)大于0.9999，線性范圍寬，線性相關(guān)性好。

圖3 苯乙醇胺A的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3.3.2 方法的靈敏度

本方法條件下，測得苯乙醇胺 A的檢測限(LOD，S/N=3)和定量限 (LOQ，S/N=10)分別為0.2μg/kg、0.5μg/kg(豬肉)和 0.2μg/L、5μg/L(豬尿)。多反應(yīng)監(jiān)測圖見圖4和圖5。

圖4 空白豬肉樣品添加苯乙醇胺A的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(0.2μg/kg、0.5μg/kg)

圖5 空白豬尿樣品添加苯乙醇胺A的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(0.2μg/L、0.5μg/L)

3.4 方法的回收率和精密度

對空白豬肉和豬尿樣品進行了3個濃度的添加回收實驗：0.5、1、2μg/kg 和 0.5、1、2μg/L。每個濃度做6次平行測定，苯乙醇胺A測定的回收率和精密度結(jié)果見表3。

表3 回收率與精密度實驗結(jié)果(n=6)

豬肉樣品的回收率為79.0% －103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1% －12.5%;豬尿樣品的回收率為80.3% －102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為：5.9% －13.7%。

4 方法的協(xié)同實驗

本方法在我中心實驗室制定完成后，與湖南省出入境檢驗局檢驗檢疫技術(shù)中心、長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心對其進行了協(xié)同驗證實驗。豬尿和豬肉各3個添加濃度、每個濃度進行6次平行測定。協(xié)同實驗結(jié)果：豬肉中0.5、1、2μg/kg 添加回收率在71.0% －107%之間，變異系數(shù)在2.1% －15.1%之間;豬尿中 0.5、1、2μg/L 添加回收率在76% －105%之間，變異系數(shù)在2.46% －11.93%之間。

5 結(jié)論

本研究建立了豬肉和豬尿中苯乙醇胺A殘留的UPLC－MS/MS快速定性和定量方法，將酶解時間從現(xiàn)有各標(biāo)準(zhǔn)中的12－16h縮短到2h，大大節(jié)約了分析時間;樣品處理方法簡單，有機溶劑消耗少，節(jié)約了分析成本。方法精密度和準(zhǔn)確度高，實用性強，適用于生豬屠宰前后豬尿和豬肉中苯乙醇胺A殘留監(jiān)控。

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