一步法和兩步法毛細管等電聚焦測定蛋白質(zhì)和多肽等電點的比較

高培峰，趙新穎，2，賀木易，劉慶生，屈鋒*

(1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081;2.北京市理化分析測試中心，北京 100089;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

蛋白質(zhì)和多肽是兩性分子，與其他非兩性生物小分子和生物大分子的顯著區(qū)別是它們具有等電點(pI)的特性。除相對分子質(zhì)量外，pI 不僅是蛋白質(zhì)和多肽的重要理化性質(zhì)之一，也是可用于表征不同蛋白質(zhì)和多肽之間性質(zhì)差異的重要參數(shù)之一。等電聚焦是測定蛋白質(zhì)和多肽的pI 值的主要方法。毛細管等電聚焦(cIEF)是基于毛細管電泳技術(shù)，根據(jù)兩性物質(zhì)的等電點差異進行分離分析的特有方法，最早由Hjerten 等［1，2］提出，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)［3-7］、多肽［8-12］、微生物顆粒(如病毒［13］、真菌［14，15］和細菌［16-18］)以及細胞器［19］等兩性生物微粒的分離分析。與毛細管區(qū)帶電泳、膠束電動色譜以及毛細管親和電泳等模式相比，cIEF 可對兩性物質(zhì)特有的pI 進行測定。但cIEF的分離過程比較復(fù)雜，實驗操作步驟多，影響因素也多，重復(fù)性較難控制，因而也是毛細管電泳多種分析模式中技術(shù)水平要求最高、難度最大的一種分析模式。

cIEF 實驗中首先需將待測組分、兩性電解質(zhì)和輔助介質(zhì)在內(nèi)的混合物溶液注入毛細管，因兩性電解質(zhì)在外加直流電場中自動形成穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH 梯度，故待測組分會自動聚焦，移至與自身pI 對應(yīng)的pH 處形成狹窄的聚焦區(qū)帶。該待測組分的聚焦區(qū)帶與陽極端的距離和毛細管的pH 梯度呈線性關(guān)系，因此，根據(jù)聚焦區(qū)帶的位置可計算出其pI 值。cIEF 分為進樣、聚焦和遷移3個步驟。當聚焦和遷移同步進行時稱為一步法，其具有體系簡單、分離速度快的優(yōu)勢。當聚焦和遷移分兩步進行時為兩步法，其具有很好的穩(wěn)定性，可準確測定樣品的pI 值，是更有效和常用的方法。

本文建立了一步法和兩步法分離5種蛋白質(zhì)和6種合成標準肽段(8～14個氨基酸殘基)的條件及其pI 測定的方法，并對這兩種方法的分析結(jié)果進行了討論和比較。盡管cIEF 有關(guān)的分析報道較多，但針對上述混合蛋白質(zhì)和肽段進行分離分析以及條件優(yōu)化的研究還沒有報道，針對一步法和兩步法進行效果對比的研究也沒有報道。本工作對于蛋白質(zhì)和多肽的pI 測定具有實際指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

細胞色素C(Cyt C)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、血紅蛋白(Hb)、肌紅蛋白(Mb)和牛血清白蛋白(BSA)，pI markers(pI 10.3/7.6/5.5/4.0)和羥丙甲基纖維素(HPMC)購自Sigma 公司。騰沖嗜熱菌合成標準肽段由北京蛋白質(zhì)組研究中心張養(yǎng)軍老師提供，編號和氨基酸序列分別為188778(LADLFYQSK)、188756(GFVIYHCAVK)、188782(TAYFAELNSYK)、188784(TATVDDIDNIYR)、188765(FWGFGSDGTVGANK)、188766(AGYTAIVSHR)。載體兩性電解質(zhì)Pharmalyte(pH 范圍分別為3～10/5～8/4～6.5)購自GE Healthcare 公司，精氨酸(Arg)購自北京拜爾迪生物科技有限公司，亞氨基二乙酸(IDA)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，NaOH、H3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、乙酸和尿素均為分析純，購自北京化工廠。實驗用水均為蒸餾水。

1.2 等電聚焦溶液配制

一步法需要載體兩性電解質(zhì)(pH 3～10)4μL，20 mmol/L PBS 緩沖液(pH 7.0)50μL;兩步法需要載體兩性電解質(zhì)pH 3～10/4～6.5/5～8分別為4μL/1μL/1μL，4 g/L HPMC 50μL，500 mmol/L Arg 4μL，100 mmol/L IDA 4.5μL，各種蛋白質(zhì)、多肽和pI marker 按需要量添加，樣品溶液組成以100μL 計，其余體積用水補足?；旌虾玫臉悠啡芤涸跍u旋振蕩器上混勻30 s，樣品需新鮮制備。

1.3 毛細管電泳條件

Beckman P/ACETMMDQ 型毛細管電泳儀配備紫外(UV)檢測器(Beckman，美國);7100毛細管電泳儀配備二極管陣列(DAD)檢測器(Agilent，美國);檢測波長280 nm，分離溫度15℃。

一步法使用熔融石英毛細管(有效長度/總長:20 cm/30.2 cm，內(nèi)徑75μm)，購自凱利奧拉色譜分析(邯鄲)有限公司。新毛細管在使用前分別用20 mmol/L NaOH和H2O 各沖洗10 min;每兩次進樣間和實驗結(jié)束后，用H2O 沖洗5 min。聚焦分離時，陽極和陰極所用電極液分別為200 mmol/L的H3PO4和NaOH，分離電壓20 kV，分離時間10 min。

兩步法采用涂層石英毛細管(有效長度/總長:20 cm/30.2 cm，內(nèi)徑75μm)，購自奧泰克生物科技有限公司(河北，中國)。新毛細管在使用前分別用20 mmol/L H3PO4和H2O 各沖洗10 min;每兩次進樣間和實驗結(jié)束后，依次用4 mol/L 尿素、20 mmol/L H3PO4和H2O 沖洗5 min。實驗結(jié)束后毛細管兩端用水封后于4℃保存。實驗采用172.37 kPa 氣壓進樣1 min;聚焦時，陽極和陰極的電極液分別為200 mmol/L H3PO4和300 mmol/L NaOH，聚焦電壓10 kV，聚焦時間5 min;分離時，陽極和陰極的電極液分別為200 mmol/L H3PO4和350 mmol/L乙酸，分離電壓為15 kV，同時加正向0.69 kPa 氣壓，分離時間15 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 一步法分離蛋白質(zhì)和多肽混合物

一步法也稱為動態(tài)聚焦法(tcIEF)，是利用pH梯度和電滲流的共同作用，使樣品區(qū)帶在聚焦過程中遷移或者在遷移過程中聚焦。如果不采用封堵劑(如:陰極封堵劑N，N，N'，N'-四甲基二乙胺(N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED))，其和普通CZE 十分相似，遷移不受限制，即為自由遷移法。利用一步法，對pI 7.6 marker和BSA 進行聚焦分離(見圖1a)，6次重復(fù)實驗測定的pI 7.6 marker和BSA的遷移時間的RSD 分別為4.7%和4.2%。利用單點法進行測算，得到BSA的pI 為4.4。利用一步法分離BSA、Hb、Mb、Cyt C和Trf 混合蛋白質(zhì)時，BSA、Hb和Mb 3種蛋白質(zhì)能得到快速分離，但峰形對稱性較差，而Cyt C和Trf 在該條件下未能檢出(見圖1b);利用一步法分離6種混合多肽時，多肽188765不能檢出(圖1c)。說明一步法可以對單種蛋白質(zhì)或多肽的pI 進行粗略測定，簡單、快速，但是對混合組分pI的測定較難實現(xiàn)。

圖1 一步法分離蛋白質(zhì)和多肽混合物的電泳圖Fig.1 Electropherograms of mixtures of proteins and polypeptides separated by one-step cIEF

2.2 兩步法分離蛋白質(zhì)和多肽混合物

兩步法是將樣品聚焦和遷移檢測過程分為兩步進行，減少聚焦和分離協(xié)同作用因素的干擾，增加過程的可控性，是目前主要采用的方法。兩步法中的聚焦過程是決定pI 測定結(jié)果準確與否的最主要因素，因此需根據(jù)預(yù)測的樣品的pI 范圍選用合適pH范圍的載體兩性電解質(zhì)，并確保聚焦過程中形成穩(wěn)定的pH 梯度。此外，聚焦溶液中載體物質(zhì)和封堵劑的種類及其組成比例也會影響聚焦實驗的重復(fù)性。而聚焦電壓和聚焦時間則是確保聚焦完全的兩個重要因素。聚焦結(jié)束后，還需控制分離條件以確保聚焦形成的樣品區(qū)帶能夠快速、完全地通過檢測器。上述因素均影響檢測結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性，因而需對其進行優(yōu)化。

2.2.1 聚焦溶液和體積

聚焦溶液中包括載體兩性電解質(zhì)、動態(tài)涂層劑、封堵劑和溶劑，其比例條件決定聚焦過程能否順利進行［20］。同時，利用相關(guān)軟件通過毛細管長度和內(nèi)徑、進樣壓力和時間4個已知參數(shù)可以計算進樣體積，以確保樣品充滿毛細管。實驗對上述因素進行了選擇和優(yōu)化，在1.3節(jié)中所列條件下BSA、Hb、Mb、Cyt C和Trf 5種蛋白質(zhì)和6種多肽可以實現(xiàn)完全聚焦及分離。

2.2.2 聚焦電壓和時間

聚焦電壓和時間影響聚焦過程中兩性電解質(zhì)形成pH 梯度的速度，也影響待測樣品在毛細管內(nèi)聚焦的速度，同時還影響聚焦過程中毛細管內(nèi)電流和焦耳熱的大?。?0］。本實驗以pI 7.6 marker 為例，對5～20 kV的聚焦電壓和時間進行了考察。結(jié)果表明:隨著電壓的增加，遷移時間變短，聚焦電流迅速增大，二者間基本呈線性變化(見圖2);當聚焦電壓為10 kV，聚焦5 min 時，電流明顯降低且保持穩(wěn)定(約5μA)，表示聚焦完成。

圖2 兩步法分離時聚焦電壓對電流和pI 7.6 marker的遷移時間的影響Fig.2 Effects of focusing voltage on current and migration time of pI 7.6 marker

2.2.3 分離條件

為減輕氣壓驅(qū)動后因?qū)恿鲗?dǎo)致的區(qū)帶展寬，可采用微弱的分離氣壓并維持一定低分離電壓的方法［20］進行分離。本實驗中，以吸附性較強的Cyt C為例，對分離電壓和分離氣壓進行了比較和優(yōu)化。在2.2.2節(jié)中優(yōu)化的聚焦條件下，分離氣壓為0.69 kPa 時，待測組分能夠獲得較好的分離;隨著分離氣壓由0.69 kPa 增加到2.07 kPa，樣品組分出峰時間提前，但分離度減小直至喪失(圖3a)。由于儀器所提供的最小壓力為0.69 kPa，此時也可適度增加分離電壓，使待測組分的遷移加快，出峰時間提前，峰形變尖銳，且分離度卻保持不變(圖3b)。綜合考慮分離時間和電泳效果，實驗中采用了15 kV 分離電壓和0.69 kPa 分離氣壓。

2.2.4 方法的重復(fù)性

5種蛋白質(zhì)中，Trf 呈現(xiàn)出兩個峰，可以測定出兩個pI 值，說明其組成相對復(fù)雜。因此以Trf和肽段188766為例，考察方法的重復(fù)性(見圖4)。測得pI7.6marker、Trf和肽段188766遷移時間的RSD均小于1.0%(n=6)，表明所建立的方法重復(fù)性好。

2.2.5 兩步法分離混合蛋白質(zhì)和混合多肽

圖3 兩步法分離Cyt C 時(a)分離氣壓和(b)分離電壓對分離效果的影響Fig.3 Effects of(a)driving pressure and(b)driving voltage on Cyt C separation by two-step cIEF

圖4 兩步法分離(a)Trf和(b)肽段188766的重復(fù)性Fig.4 Repeatabilities of(a)Trf and(b)peptide 188766 separations by two-step cIEF

將優(yōu)化的兩步法條件用于單一組分的5種蛋白質(zhì)和肽段的pI 測定時，可得到準確的pI。用于蛋白質(zhì)混合物和肽段混合物的pI 測定時，應(yīng)先分析4種pI marker和每種單一組分的出峰時間，再分離pI marker與5種蛋白或6種肽段的混合組分，以確定每種組分的出峰位置，其分離色譜圖見圖5a和b。對pI marker的pI 值與其遷移時間進行二次曲線擬合(圖5c和d)，根據(jù)二次曲線計算所測5種蛋白質(zhì)和6種多肽的pI 值，結(jié)果與單組分測定時相近(見表1)。其中，結(jié)果差異較大的是蛋白質(zhì)Cyt C和多肽188778、188765，三者的pI 值均有0.2個pH 單位的差值。對6種混合肽段進行檢測時，多肽188756不能檢出，但對其進行單獨進樣時，其出峰位置緊鄰pI 7.6 marker(圖5b 中*處)，說明其等電點應(yīng)與7.6相近，其峰可能被pI 7.6 marker 掩蓋，二者相互干擾。

圖5 兩步法分離(a)混合蛋白質(zhì)和(b)混合肽段的色譜圖及(c和d)對應(yīng)的pI marker的pI 值和遷移時間的曲線關(guān)系Fig.5 Chromatograms of mixtures of(a)proteins and(b)polypeptides by two-step cIEF and(c and d)curvilinear relationships between pI and migration time of the pI markers respectively

表1 單一組分蛋白質(zhì)和多肽與混合樣品采用兩步法測定的pI 值比較Table 1 Comparison of pI determined for single protein/polypeptide and mixtures by two-step cIEF

2.3 一步法與兩步法比較

以BSA 為例，其等電點的報道值在4.6～5.8之間。本實驗中，采用一步法測定時，BSA的遷移時間約為2 min，pI 值為4.4;采用兩步法測定時其遷移時間約為10.5 min，pI 值為5.3。一步法雖然簡單，比兩步法分離速度快，但測定結(jié)果不如兩步法精確。

一步法分離在速度上具有明顯優(yōu)勢，5 min 之內(nèi)即能完成聚焦分離全過程，可以實現(xiàn)對單一組分的分析，重現(xiàn)性好，所測pI 結(jié)果比較準確。但對多種蛋白質(zhì)或者多肽的混合樣品則分離度不夠，不能準確測定pI。如果在實際樣品分析時，經(jīng)區(qū)帶電泳表征后發(fā)現(xiàn)樣品組分單一，純度較高，可以首選一步法進行測定。但因一步法分離過程受到電滲流的影響，pI與遷移距離的線性關(guān)系范圍處在很狹窄的區(qū)間，因此要求pI 準確測定時，建議使用一步法并需兩步法進行校正。

兩步法的分離體系較前者復(fù)雜，且分離時間長，但所得各組分的峰具有良好的分離度，且各組分的出峰時間與梯度pH 相對應(yīng)，可進行pI的準確測定。如果是未知生物樣品，需先進行毛細管區(qū)帶電泳表征，確定其是否為多組分混合體系，以及確定其基本組成。再采用兩步法進行樣品分離的條件優(yōu)化，選擇優(yōu)化條件進行pI 測定。兩步法用于pI 測定時，結(jié)果的準確性高于一步法。

3 結(jié)論

毛細管電泳具有高效、快速、低成本優(yōu)勢，適合用于快速表征蛋白質(zhì)和多肽的性質(zhì);cIEF 更是蛋白質(zhì)和多肽等電點測定的有效方法和手段，簡便的一步法可與準確的兩步法相互結(jié)合，互為補充，可實現(xiàn)對單一組分和多組分樣品pI的準確測定，具有十分廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)或多肽由于糖基化、磷酸化等修飾，或由于暴露在不同的理化環(huán)境中而導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)改變，以及某些蛋白質(zhì)不同亞型之間存在的精細結(jié)構(gòu)差異，往往使其pI 值發(fā)生改變。因此，毛細管等電聚焦不僅可準確測定蛋白質(zhì)的pI 值，也能夠通過pI 值變化的測定為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究提供參考。

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