基于巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)制備有機(jī)-無機(jī)雜化硼酸親和整體柱用于糖蛋白的選擇性富集

楊帆，毛劼，何錫文，陳朗星*，張玉奎，2

(1.南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院，天津 300071;2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023)

糖蛋白是一類重要的翻譯后修飾蛋白，它是由糖鏈在多肽鏈上以多種形式共價(jià)修飾而成的一類重要的生理活性物質(zhì)。糖蛋白在生物體內(nèi)種類繁多，分布廣泛，與人體中很多重要的生物學(xué)過程密切相關(guān)［1，2］。因此，對(duì)糖蛋白的研究具有十分重要的生物學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。通常糖蛋白在復(fù)雜生物體系中的絕對(duì)豐度都非常低，高豐度的非糖蛋白的存在會(huì)對(duì)低豐度的糖蛋白產(chǎn)生干擾和掩蓋。雖然生物質(zhì)譜技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，但是對(duì)于低豐度的糖蛋白或糖肽的分析還是無能為力，為了解決這一瓶頸問題，多種糖蛋白或糖肽的分離富集技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生［3-6］。在復(fù)雜的生物體系中，通過選擇性地分離、富集低豐度糖蛋白來排除高豐度非糖蛋白的干擾是目前糖蛋白鑒定和研究的有效策略。近幾年來，硼酸親和技術(shù)在糖蛋白分離富集領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展。硼酸親和作用的機(jī)理是硼酸基團(tuán)在堿性條件下與帶有順式二醇(cis-diol)基團(tuán)的物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的五或六元環(huán)酯結(jié)構(gòu)，當(dāng)介質(zhì)的pH 切換為酸性時(shí)則可實(shí)現(xiàn)可逆的解離［7］。利用硼酸這種可逆結(jié)合的性質(zhì)，硼酸親和技術(shù)已發(fā)展成為一種選擇性富集含順式二醇基團(tuán)化合物的有效提純手段。

整體柱作為一種新型分離介質(zhì)，具有制備簡單、通透性好、傳質(zhì)快等優(yōu)點(diǎn)，在生物分離分析中發(fā)揮的作用日益增大［8，9］。將整體柱與硼酸親和技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前硼酸親和材料的一個(gè)發(fā)展方向。硼酸親和整體柱結(jié)合了整體柱材料與硼酸親和技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，近年來受到了很大關(guān)注［10］。2006年P(guān)otter等［11］首先在毛細(xì)管中合成了硼酸親和整體柱，并在微液相色譜模式和毛細(xì)管電色譜模式下實(shí)現(xiàn)了核苷類物質(zhì)的分離、富集。Chen 等［12］采用3-丙烯酰胺基苯硼酸作為功能單體原位聚合制備了有機(jī)基質(zhì)硼酸親和整體柱，并將其作為一種固相微萃取柱用于萃取核苷和糖蛋白，擴(kuò)展了硼酸親和整體柱的應(yīng)用范圍。Liu 等［13-16］研究了一系列苯硼酸衍生物為功能單體合成可在中性條件下工作的硼酸親和整體柱，為硼酸親和整體柱的設(shè)計(jì)和制備提供了更多選擇。隨后Lin 等［17］和Liu 等［18］利用“一鍋法”［19，20］制備了有機(jī)-無機(jī)雜化硼酸親和整體柱，將新的整體柱載體引入硼酸親和技術(shù)中，制備的硼酸親和整體柱顯示了優(yōu)良的性能。

在色譜分離領(lǐng)域，Cu(I)催化疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)(Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)［21］作為典型的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)已應(yīng)用于液相色譜固定相的制備中［22］。我們采用CuAAC 反應(yīng)制備疏水聚合物整體柱［23，24］和硼酸有機(jī)-無機(jī)雜化硼酸親和整體柱［25］，并成功用于蛋白質(zhì)的分離。巰基-烯(thiol-ene)反應(yīng)是另一類典型的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)不需要加入催化劑，不會(huì)在產(chǎn)物中造成重金屬殘留，在光引發(fā)或熱引發(fā)的條件下即可快速反應(yīng)。利用其制備色譜固定相，具有制備簡單、反應(yīng)條件溫和、可控性好等優(yōu)點(diǎn)，可形成具有特殊交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合物，在聚合物材料的制備中受到越來越多的關(guān)注［26］。

本文采用溶膠-凝膠和巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)兩步制備有機(jī)-無機(jī)雜化硼酸親和整體柱，建立了一種制備硼酸親和整體柱的新路線。首先以四甲氧基硅烷(TMOS)和巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)作為反應(yīng)單體，采用溶膠-凝膠反應(yīng)制備表面含巰基的硅膠整體柱。然后利用巰基-烯反應(yīng)在整體柱上修飾硼酸配基3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)，制成AAPBA-硅膠雜化親和整體柱，并成功用于含順式二醇的核苷和糖蛋白的分離。相比“一鍋法”路線［17，18］，本方法先合成帶有活性位點(diǎn)的整體骨架材料，再通過點(diǎn)擊反應(yīng)將硼酸配基接枝到整體柱上。所得材料的功能基團(tuán)均分布在骨架表面，避免了功能基團(tuán)被包埋在骨架中的問題，更利于其與目標(biāo)分子作用。并且所得的骨架中間體可以用于接枝不同性質(zhì)和功能的硼酸基團(tuán)，從而可以用于制備多種類型的硼酸親和整體材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀SPD-M20A(日本島津公司)，配置兩臺(tái)LC-20AD 泵、一臺(tái)DGU-20A5在線脫氣機(jī)以及一個(gè)SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器，色譜數(shù)據(jù)的采集和處理在LCsolution 工作站完成;艾科浦Aquaprince 超純水機(jī);Bruker AV-400型核磁共振(NMR)儀;FTS6000型紅外光譜儀(美國Bio-Rad 公司);SS-550型掃描電子顯微鏡(日本島津公司)。

TMOS和MPTMS 購自湖北武大有機(jī)硅新材料股份有限公司;間氨基苯硼酸(APBA)購自北京元素科技化學(xué)有限公司;丙烯酰氯購自美國Acros 公司。聚乙二醇(PEG，Mr10000)及偶氮二異丁腈(AIBN)購自天津化學(xué)試劑廠，AIBN 經(jīng)甲醇重結(jié)晶處理。腺苷、脫氧腺苷、人血清白蛋白(HSA)、核糖核酸酶A(RNase A)、卵清白蛋白(OVA)、辣根過氧化物酶(HRP)購自美國Sigma-Aldrich 公司。其他化學(xué)試劑均為分析純及以上級(jí)別，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。不銹鋼柱(100 mm ×4.6 mm)購自天津譜祥科技有限公司。

1.2 AAPBA-硅膠雜化整體柱的制備

1.2.1 有機(jī)單體AAPBA的合成

有機(jī)單體AAPBA的合成參考文獻(xiàn)［27］并進(jìn)行了一些修改，具體如下:將1.0 g APBA 溶解于25 mL NaOH 溶液(1.2 mol/L)中，置于冰水浴中冷卻。于0℃劇烈攪拌的條件下，逐滴緩慢地加入1.2 mL 丙烯酰氯。反應(yīng)1 h 后，加入1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)混合物溶液的pH 至1.0，得到白色固體沉淀物。過濾沉淀物，用50 mL 冷水洗滌5次。將所得沉淀物溶解在20 mL 水中并加熱至60℃，濾掉雜質(zhì)。濾液在0℃條件下靜置過夜，得到白色針狀晶體，過濾后用冷水洗滌。然后放入真空烘箱中干燥，即得AAPBA。AAPBA的1H NMR 數(shù)據(jù)如下:δ10.07(s，1H，NH)，δ8.02(s，2H，B-OH)，δ7.88(s，1H，Ar-H)，δ7.81(d，1H，Ar-H)，δ7.49(d，1H，Ar-H)，δ7.28(t，1H，Ar-H)，δ6.46(dd，1H，CH)，δ6.27(dd，1H，C=CH2)，δ5.74(dd，1H，C=CH2)。

1.2.2 巰基修飾的硅膠整體柱的制備

將0.1 g PEG 溶于2 mL 0.2 mol/L 乙酸溶液，加入1 mL TMOS、0.3 mL MPTMS和0.5 mL 甲醇，在冰水浴中激烈攪拌使其水解，得到透明均一溶液。超聲1 min 后，用注射器將混合物注入不銹鋼柱中。不銹鋼柱兩端密封置于55℃烘箱中反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后依次用水、甲醇沖洗整體柱，將致孔劑和未反應(yīng)完的殘余試劑除去。

1.2.3 巰基-烯反應(yīng)制備AAPBA-硅膠雜化整體柱

利用巰基-烯反應(yīng)將AAPBA 鍵合在巰基修飾硅膠整體柱上，條件如下:將0.2 g AAPBA，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))AIBN 溶于15 mL 甲醇中，渦流攪拌混勻，經(jīng)0.45μm 濾膜過濾。將巰基硅膠整體柱連接液相泵并置于60℃柱溫箱中，循環(huán)泵入AAPBA 修飾液，巰基-烯反應(yīng)24 h 后依次用甲醇和水沖洗整體柱以除去殘余試劑。

1.3 AAPBA-硅膠雜化整體柱的動(dòng)態(tài)吸附容量

采用前沿分析法測(cè)定AAPBA-硅膠雜化整體柱的動(dòng)態(tài)吸附容量［27］。分別以腺苷和OVA 作為測(cè)試物，脫氧腺苷和HSA 作為死時(shí)間標(biāo)記物，測(cè)定不同pH 條件下AAPBA-硅膠雜化硼酸親和整體柱對(duì)含順式二醇基團(tuán)生物分子的動(dòng)態(tài)吸附容量。測(cè)試前用磷酸鹽緩沖溶液充分平衡硼酸親和柱直至基線穩(wěn)定。再將含有1 g/L 測(cè)試物和0.01 g/L 標(biāo)記物的緩沖溶液以恒定流速通過整體柱。當(dāng)整體柱吸附測(cè)試物達(dá)到飽和后，測(cè)試物流出整體柱進(jìn)入檢測(cè)器。不同pH 條件下的動(dòng)態(tài)吸附容量(Q，mg/g)計(jì)算公式如下:

式中VB(mL)為整體柱突破體積的10%(突破曲線10%高處)，V0為整體柱中的死體積(mL)，C 為測(cè)試物的質(zhì)量濃度(mg/mL)，m 為整體柱的干質(zhì)量(g)。測(cè)試后用0.2 mol/L 醋酸溶液洗脫測(cè)試物，再用磷酸鹽緩沖液沖洗整體柱至平衡后繼續(xù)測(cè)試。

1.4 色譜條件

實(shí)驗(yàn)中所用的液相泵流速為0.5 mL/min，選用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液和0.2 mol/L 醋酸溶液作為梯度洗脫液。對(duì)核苷等分析物質(zhì)的色譜檢測(cè)波長為260 nm，對(duì)糖蛋白等分析物質(zhì)的色譜檢測(cè)波長為214 nm。樣品溶液使用0.1 mol/L 磷酸鹽(pH 7.5)緩沖液配制，進(jìn)樣量為20μL。所有流動(dòng)相和樣品溶液使用前均經(jīng)0.45μm 濾膜(Nihon Millipore Ltd.)過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 AAPBA-硅膠雜化整體柱的制備條件優(yōu)化

AAPBA-硅膠雜化整體柱的制備過程如圖1所示。在制備巰基硅膠整體柱的過程中，TMOS與MPTMS的比例、PEG和甲醇用量對(duì)雜化整體柱形貌及機(jī)械性能有較大影響，因此對(duì)這些因素進(jìn)行了考察(見表1)。

改變TMOS與MPTMS的比例，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MPTMS的比例較高時(shí)，反應(yīng)物很難混合均勻，無法形成均勻的水解溶液。當(dāng)TMOS和MPTMS的體積比為10∶3時(shí)，兩相可以較好互溶，混合物體系在冰水浴中4 h可形成均一透明的溶液。

圖1 巰基-烯法制備AAPBA-硅膠雜化整體柱Fig.1 Preparation of AAPBA-silica hybrid monolith via“thiol-ene”click reaction

PEG 在聚合體系中除了具有致孔的作用之外，還會(huì)影響到溶膠-凝膠反應(yīng)過程中的相分離過程［28］。保持體系中其他反應(yīng)物的量不變，改變PEG的含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PEG的含量為0.2 g 時(shí)，形成的整體柱骨架呈半透明態(tài)，質(zhì)地硬脆，通透性差;當(dāng)PEG的含量為0.1 g 時(shí)，得到的整體柱骨架致密均勻，機(jī)械穩(wěn)定性能好，同時(shí)具有良好的滲透性，適合用于較高流速條件下的色譜分析。

表1 巰基硅膠整體柱的制備條件Table 1 Conditions for the preparation of mercaptopropylmodified silica monoliths

以TMOS和MPTMS 為前軀體的溶膠-凝膠體系中，甲醇的存在可以改善硅烷化試劑在水相中的溶解，并且會(huì)對(duì)骨架的形貌產(chǎn)生影響。經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中不含甲醇時(shí)，反應(yīng)體系需要較長時(shí)間才能形成均一溶液，得到的整體柱骨架質(zhì)地硬，通透性較差。當(dāng)甲醇的含量為0.5 mL 時(shí)，反應(yīng)混合物能夠較好互溶，可在較短時(shí)間內(nèi)得到均勻的溶液。然而甲醇的含量太高將會(huì)導(dǎo)致形成的整體柱骨架極易收縮。

經(jīng)過優(yōu)化，當(dāng)預(yù)聚液的組成為TMOS 1.0 mL、MPTMS 0.3 mL、PEG 0.1 g、甲醇0.5 mL、0.2 mol/L HAc 2 mL 時(shí)，合成的巰基硅膠整體柱具有通透的骨架結(jié)構(gòu)和良好的機(jī)械穩(wěn)定性。

2.2 AAPBA-硅膠雜化整體柱的表征

使用FT-IR 對(duì)AAPBA-硅膠雜化整體柱的制備過程進(jìn)行表征(見圖2)。曲線a 為巰基硅膠整體柱的紅外吸收曲線，在2562 cm-1處出現(xiàn)巰基的弱吸收峰。曲線b 為AAPBA-硅膠雜化整體柱的紅外吸收曲線，1668 cm-1和1550 cm-1處出現(xiàn)酰胺基團(tuán)的特征峰，1610 cm-1和1491 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的伸縮振動(dòng)峰，705 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)間位取代的峰，655 cm-1處出現(xiàn)C-S 鍵的特征峰。結(jié)果證明AAPBA 被成功地接枝到巰基硅膠整體柱上。

圖2 (a)巰基硅膠整體柱與(b)AAPBA-硅膠雜化整體柱的紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of(a)mercaptopropyl-modified silica monolith and(b)the AAPBA-silica hybrid boronate affinity monolith

用掃描電鏡來表征最優(yōu)化條件下制備的AAPBA-硅膠雜化整體柱的形貌特征。從圖3中可以清晰地看出巰基硅膠整體柱的硅膠骨架高度交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且骨架中存在大尺寸的貫穿通孔，為點(diǎn)擊法修飾AAPBA 提供了空間。經(jīng)巰基-烯反應(yīng)后得到的整體柱骨架呈現(xiàn)出相互貫通的、分布均勻的連續(xù)結(jié)構(gòu)，具有可供流動(dòng)相快速流過的大尺寸通孔(孔徑約2～4μm)。這些均勻大孔結(jié)構(gòu)的存在可以降低傳質(zhì)阻力，改善整體柱的滲透性能。

為了考察AAPBA-硅膠雜化整體柱的機(jī)械強(qiáng)度，分別用水和甲醇作為流動(dòng)相測(cè)定流速與柱壓的關(guān)系。如圖4所示，在0.1～5.0 mL/min的范圍內(nèi)，整體柱的柱壓隨流速增加呈線性增加。以水為流動(dòng)相，柱壓(y，MPa)與流速(x，mL/min)的線性方程為y=1.61x-0.24，相關(guān)系數(shù)R=0.995;以甲醇為流動(dòng)相，線性方程為y=1.05x-0.05，相關(guān)系數(shù)R=0.997。表明該雜化硼酸親和整體柱具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，在較高的流速下也能保持穩(wěn)定的形態(tài)。

圖3 (a)巰基硅膠整體柱與(b)AAPBA-硅膠雜化整體柱的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of(a)mercaptopropyl-modified silica monolith and(b)the AAPBA-silica hybrid monolith

圖4 AAPBA-硅膠雜化整體柱的機(jī)械穩(wěn)定性Fig.4 Mechanical stability of the AAPBA-silica hybrid monolith

滲透性是評(píng)價(jià)整體柱性能的一個(gè)重要指標(biāo)。整體柱的滲透性(B0)根據(jù)Darcy 公式［29］計(jì)算:

式中F 為流動(dòng)相流速(m3/s)，η為流動(dòng)相的黏度(Pa·s)，L 為整體柱的長度(m)，r 為整體柱的內(nèi)半徑(m)，ΔP 為相應(yīng)流速下對(duì)應(yīng)的柱壓降(Pa)。經(jīng)過計(jì)算，AAPBA-硅膠雜化硼酸親和整體柱在水相中B0=8.4×10-14m2(η=1.005×10-3Pa·s，20℃)，有機(jī)相中B0=5.8×10-14m2(η=0.580×10-3Pa·s，20℃)，表明該雜化整體柱在不同極性的流動(dòng)相條件下都表現(xiàn)出良好的通透性。另外，該雜化整體柱在水和有機(jī)流動(dòng)相中的B0差值很小，這可以解釋為其具有良好的耐溶劑性能，在不同的溶劑中都表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

整體柱的重現(xiàn)性是評(píng)價(jià)制備方法有效性和實(shí)用性的重要指標(biāo)。本工作中以腺苷保留時(shí)間的RSD來評(píng)價(jià)制備方法的重現(xiàn)性。腺苷在同一根柱上連續(xù)5次進(jìn)樣的保留時(shí)間RSD 為1.88%，在同一批次5根不同柱上保留時(shí)間的RSD 為5.69%，在3根不同批次柱上的保留時(shí)間RSD 為8.60%。說明本工作中采用的制備方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.3 AAPBA-硅膠雜化整體柱的親和性能

由于硼酸配基AAPBA的pKa值較低［18］，因此在中性pH 條件下，AAPBA-硅膠雜化硼酸親和整體柱對(duì)含有順式二醇結(jié)構(gòu)的生物分子表現(xiàn)出良好的親和能力。選用腺苷和脫氧腺苷作為對(duì)比分析物，研究雜化硼酸整體柱對(duì)含有順式二醇結(jié)構(gòu)的生物小分子的親和性能，結(jié)果如圖5所示。作為一種典型的具有順式二醇結(jié)構(gòu)的化合物，腺苷在pH 7.5的條件下被保留在雜化硼酸親和整體柱中，而脫氧腺苷則沒有保留地流出整體柱;在10 min 時(shí)切換到酸性流動(dòng)相，腺苷被成功洗脫。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與硼酸親和作用機(jī)理相符，說明硼酸親和整體柱對(duì)順式二醇化合物具有良好的親和性能。

圖5 腺苷與脫氧腺苷在AAPBA-硅膠雜化整體柱上的色譜保留行為Fig.5 Chromatographic retention behaviors of adenosine and 2-deoxyadenosine on the AAPBA-silica hybrid monolith

糖蛋白與非糖蛋白在AAPBA-硅膠雜化整體柱上有明顯不同的保留行為，如圖6所示。在pH 7.5時(shí)，非糖蛋白HSA和RNase A 在約4 min 出峰，而糖蛋白HRP和OVA 則被完全保留在整體柱中。10 min 時(shí)將流動(dòng)相切換為酸性，可實(shí)現(xiàn)糖蛋白的可逆洗脫。經(jīng)AAPBA-硅膠雜化整體柱處理后可以實(shí)現(xiàn)糖蛋白與非糖蛋白的有效分離，表明該整體柱對(duì)糖蛋白具有良好的親和選擇性，是分離富集糖蛋白的一種有效方法。

動(dòng)態(tài)吸附容量是評(píng)價(jià)AAPBA-硅膠雜化整體柱親和性能的重要參數(shù)。在不同pH 條件下，腺苷的動(dòng)態(tài)吸附容量QAD(mg/g)和OVA的動(dòng)態(tài)吸附容量QOVA(mg/g)如表2所示。隨著pH的升高，QAD由3.18 mg/g 增至7.12 mg/g，QOVA由1.95 mg/g 增至6.15 mg/g，略低于CuAAC 點(diǎn)擊反應(yīng)制備的硼酸親和整體柱［25］。但與CuAAC 法相比，巰基-烯法不需要引入重金屬催化劑，制備過程更加安全。AAPBA-硅膠雜化整體柱在較高pH 條件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和吸附能力，這與硼酸親和作用機(jī)理相符。然而該硼酸親和整體柱在中性條件下仍表現(xiàn)出對(duì)具有順式二醇結(jié)構(gòu)的化合物的親和能力，表明AAPBA-硅膠雜化整體柱可在中性條件下用于糖蛋白的分離分析，中性的分離條件對(duì)蛋白的分析具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖6 糖蛋白與非糖蛋白在AAPBA-硅膠雜化整體柱上的色譜保留行為Fig.6 Chromatographic retention behaviors of glycoproteins and nonglycoproteins on the AAPBA-silica hybrid monolith

表2 AAPBA-硅膠雜化整體柱在不同pH 條件下的動(dòng)態(tài)吸附容量Table 2 Binding capacity of the AAPBA-silica hybrid monolith under different pH conditions

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種以巰基-烯反應(yīng)制備有機(jī)-無機(jī)雜化硼酸親和整體柱的新方法。該方法制備的整體柱具有均勻的孔結(jié)構(gòu)、良好的通透性、穩(wěn)定的機(jī)械性能和硼酸親和能力，可選擇性分離含有順式二醇結(jié)構(gòu)的生物分子。并且這種新型硼酸親和整體柱能在中性條件下選擇性吸附含有順式二醇的生物分子，表明其在糖蛋白富集領(lǐng)域有較好的發(fā)展前景。硼酸親和整體柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白的定量回收實(shí)驗(yàn)及血樣中糖蛋白的定量提取正在進(jìn)行中。

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