雙重免疫組化技術在乳腺癌組織芯片中的應用

陳慧，徐琳瑜，鐘曉怡，郜恒駿

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雙重免疫組化技術在乳腺癌組織芯片中的應用

陳慧，徐琳瑜，鐘曉怡，郜恒駿

201203 上海芯超生物科技有限公司

在生物醫(yī)學和臨床研究實踐中，經(jīng)常需要檢測兩種不同物質(zhì)是否在同一樣品或同一種細胞中共存，最好使用雙重染色法在同一個組織樣本上進行雜交。雙重染色的方法有兩種類型，免疫酶組織化學和免疫熒光化學法。目前，在實體腫瘤中，由于甲醛固定石蠟包埋組織過高的熒光信號，免疫熒光法更適合用于冰凍保存的組織[1]。雙重免疫酶組織化學需要選擇不同顯色底物、不同的抗體、不同修復方法進行搭配，操作繁瑣，在科研使用比較廣泛，但臨床操作要求穩(wěn)定性高、操作簡單，所以在臨床不常規(guī)使用。隨著科技進步、技術發(fā)展，出現(xiàn)越來越多穩(wěn)定性好、操作簡單的試劑，可以解決上述問題。雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、C-erbB-2、E-鈣黏蛋白（E-cadhein）、p53 這些抗體大都是經(jīng)典的抗體，純度高，定位準確，不會出現(xiàn)因為定位不準確或非特異性表達導致對結果的判讀誤導。而乳腺癌細胞胞漿豐富，呈嗜酸性，伴有多個核仁且明顯，且成片生長較容易區(qū)分。本實驗通過在乳腺癌上表達定位準確、位置單一的抗體進行免疫組化單染和雙染的比較，看是否存在結果上的差異，以探討在臨床上進行雙重免疫組化的可行性和操作的難易程度，從而達到在臨床上廣泛應用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 32 例乳腺癌標本取自生物芯片上海國家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司組織庫國家 863 項目協(xié)作醫(yī)院近 2 年新鮮手術切除及存檔標本，患者均為女性，年齡 33 ~ 93 歲，中位年齡 55歲；其中 II 級浸潤性導管癌 8 例，III 級浸潤性導管癌 24 例。全部病例術前均未作化療或放療。所有組織標本取出后迅速用 10% 中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋備用。

1.1.2 實驗試劑與儀器 Polink DS-MR Kit for Double Staining Kit 購自 GBI 公司；抗體 ER、RMA-0501 即用型兔抗PR、RMA-0502 即用型兔抗 C-erbB-2、MAB-0198 即用型鼠抗購自福州邁新公司；抗體 E-cadhein、濃縮型兔抗/抗體p53 購自美國 Cell Signaling 公司；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）購自丹麥 Dako 公司；哈氏蘇木素購自美國 Sigma 公司。

Aperio 圖像成像分析系統(tǒng)為美國Aperio 公司產(chǎn)品；全自動染片機為德國 Lecia 公司產(chǎn)品；顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化單染 常規(guī)免疫組化操作步驟：①脫蠟、抗原修復、阻斷：將組織芯片放入 65 ℃烘箱，烘蠟 1 h。片子烘烤完成后，放入全自動染色機中，進行脫蠟；以檸檬酸高壓修復；將片子放入阻斷劑中 10 min；②一抗室溫 30 min：其中 ER、PR、C-erbB-2 是即用型抗體，E-cadhein 使用稀釋度 1:600、p53 使用稀釋度 1:50；③二抗、顯色：滴加二抗工作液，孵育 30 min；在片子上滴加稀釋后的 DAB，顯色 5 min，自來水沖洗；④復染、封片：滴加哈氏蘇木素復染 1 min 后在鹽酸酒精中浸沒2 s，用自來水沖洗，通風櫥自然晾干后用中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組化雙染 免疫組化雙染操作步驟：①脫蠟、抗原修復、阻斷：與免疫組化單染相同。②一抗、二抗和顯色：若兩個一抗來源不同種屬（兔抗和鼠抗），將 p53 按 1:50 的稀釋度用C-erbB-2 抗體稀釋，室溫 30 min 后，片子用 PBS 沖洗，滴加 HRP + AP 混合二抗，室溫孵育 30 min；在片子上滴加稀釋后的 DAB，顯色 10 min，自來水沖洗；滴加快紅的工作液在樣本上，孵育 20 min，自來水沖洗。若兩個一抗來源于同一種屬（兔抗），加即用型 ER 或 PR 室溫 30 min 后，片子用 PBS 沖洗，滴加 HRP 二抗工作液，孵育 30 min；在片子上滴加稀釋后的 DAB，顯色 10 min，自來水沖洗；滴加 GBI 的封閉液30 min， E-cadhein 稀釋度 1:600，室溫 30 min，加 AP 二抗工作液 30 min；滴加稀釋后的快紅，孵育20 min，自來水沖洗。③復染、封片：滴加哈氏蘇木素復染 15 s，用自來水沖洗，將玻片放在 PBS 中直到出現(xiàn)藍色，通風櫥自然晾干后用中性樹膠封片。

1.2.3 陰性對照 在免疫組化雙染過程中加一張同一型號的組織芯片，用 PBS 替代一抗。

1.2.4 判斷標準 根據(jù)參考文獻[2]，C-erbB-2 陽性部位在細胞膜，結果判讀標準為 0：無著色；l+：任何比例的浸潤癌細胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細胞膜著色；2+：> 10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)弱至中等強度、完整但不均勻的細胞膜棕黃著色或 < 30%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)強且完整的細胞膜棕褐著色；3+：> 30%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)強的、完整的細胞膜棕褐著色。p53、ER、PR 陽性部位在細胞核，E-cadhein陽性部位在細胞膜。結果判讀標準：（–）即無陽性染色，此為 0 分；（±）即可疑陽性，此為1 分；（+）即弱陽性，此為 2 分；（++）即中等陽性，此為 3 分；（+++）即強陽性，此為 4 分；將陽性細胞百分比分 5 個等級。無陽性細胞為 0 分，陽性細胞≤25% 為 1 分，26% ~ 50% 為2 分，51% ~ 75% 為 3 分，> 75% 為 4 分。著色強度和數(shù)量積分相加，0 分是（–），2 ~ 3 分是（±），4 ~ 5 是（+），6 ~ 7（++），8 分是（+++）。其中（+）和（++）判斷為陽性[3]。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料采用2檢驗，α 取 0.05。

2 結果

因為免疫組化雙染在同一張組織切片上表達不同的抗體，所以抗體之間的組合不能重疊。例如：p53、ER、PR 都是細胞核陽性表達，所以不能在同一張組織切片上表現(xiàn)，C-erbB-2 和 E-cadhein 是細胞膜陽性表達，也不能將該兩個抗體組合。所以在本實驗中，p53 和C-erbB-2 作為一組抗體，ER 和 E-cadhein 作為一組抗體，PR 和 E-cadhein 作為一組抗體進行實驗。在免疫組化單染中，32 例乳腺浸潤性導管癌中 ER、PR、p53、C-erbB-2、E-cadhein 的陽性率分別為 47%（15/32）、31%（10/32）、41%（13/32）、53%（17/32）、84%（27/32），而免疫組化雙染 p53 和C-erbB-2相互組合，其中 p53 棕色表達在細胞核而C-erbB-2 紅色表達在細胞膜（圖 1）；p53/C-erbB-2、ER/E-cadhein、PR/E-cadhein 中單個抗體的陽性表達率分別是 37.5%（12/32）/53%（17/32），44%（14/32）/78%（25/32），28%（9/32）/78%（25/32）（表 1）。只有單個抗體表達的結果如圖 2、圖 3 所示，ER、PR、p53、C-erbB-2、E-cadhein 免疫組化單染和雙染結果之間的值分別為 0.78、0.517、0.886、0.908、0.063，均大于 0.05，說明該兩組數(shù)據(jù)之間沒有差異，也就是說用免疫組化單染和免疫組化雙染的實驗結果沒有差異。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移或診斷是一個多步驟的復雜過程，在實際病理診斷中，由于制片原因，在常規(guī)的 HE 染色中，腫瘤細胞與正常細胞無法區(qū)分[4]，有時候需要知道兩種蛋白分子表達、轉(zhuǎn)運或代謝的相關性[5]。免疫組化雙染通過不同的顯色系統(tǒng)可以很好地解決這些問題。常規(guī)標本的保存方法是甲醛固定石蠟包埋，具有可室溫保存而不需特殊設備，保存時間久等特點。而因為石蠟切片的自發(fā)熒光的問題，不適用免疫熒光，而適用免疫組織化學法。以前免疫組化雙染由于操作步驟繁瑣、重復性差而只廣泛應用于科研領域，在臨床上應用較少。本實驗通過 ER、PR、E-cadhein、C-erbB-2、p53 等幾個定位清晰準確的抗體在乳腺癌上進行單染和雙染表達，探討其在臨床上廣泛應用的可行性。

圖 1 p53 和 C-erbB-2 均表達的免疫組化雙染和免疫組化單染結果圖（A：免疫組化雙染的陰性對照；B：免疫組化雙染，p53 為核陽性，棕色顯色；C-erbB-2 為膜陽性，紅色顯色；C：免疫組化單染，p53 為核陽性，棕色顯色；D：免疫組化單染，C-erbB-2 為膜陽性，棕色顯色）

表 1 免疫組化單染和雙染的數(shù)據(jù)結果

注：ER 的免疫組化單染和雙染的2= 1.390（= 0.78），PR 的免疫組化單染和雙染的2= 2.277（= 0.517），p53 的免疫組化單染和雙染的2= 0.644（= 0.886），C-erbB-2 的免疫組化單染和雙染的2= 0.551（= 0.908），E-cadhein 的免疫組化單染和雙染的2= 7.294（= 0.063）。

圖 2 只有 p53 表達的免疫組化雙染和免疫組化單染結果圖（A：免疫組化雙染，p53 為核陽性，棕色顯色；C-erbB-2 不表達；B：免疫組化單染，p53 為核陽性，棕色顯色；C：免疫組化單染，C-erbB-2 不表達）

圖 3 只有 C-erbB-2 表達的免疫組化雙染和免疫組化單染結果圖（A：免疫組化雙染，p53 不表達；C-erbB-2 膜陽性，染紅色；B：免疫組化單染，p53不表達；C：免疫組化單染，C-erbB-2 為膜陽性，棕色顯色）

和常規(guī)免疫組化相比，免疫組化雙染在原理上是相同的，都是利用抗原與抗體間的特異性結合原理和特殊的標記技術，對組織和細胞內(nèi)的特定抗原或抗體進行定位、定性或定量檢測[6]。作為免疫酶組織化學標記物的酶以共價鍵的形式結合在抗體上，制成酶標抗體，再借助酶對底物的特異催化作用，生成有色不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，光鏡或電鏡下進行細胞表面或細胞內(nèi)部各種抗原成分的定性和定位研究。從理論上講。用細胞化學方法能顯示的酶均可用于免疫酶組織化學標記物，但實際上能用于免疫組織化學技術的酶并不多。通常是辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。辣根過氧化物酶廣泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，它的分子量約 40 kD，穩(wěn)定性好，其底物為過氧化物和供氫體，可以結合 DAB、3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethylcarbozole，AEC）。AEC 形成紅色不溶性產(chǎn)物，但易溶于有機溶劑。DAB 是無色還原型染料，能被氧化生成不溶于水且不易褪色的棕色氧化性染料，所以實驗室最常使用的是 DAB。堿性磷酸酶系小牛腸黏膜和大腸桿菌中提煉出來的一種磷酸酯的水解酶，它通常結合的顯色基團有四唑氮藍（nitro-blue-tetrazolium，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl- phosphate，BCIP）、AP-Red、快紅（Fast-Red）。其中 AP-Red 和快紅均在反應位點產(chǎn)生紅色沉淀，但都易溶于酒精，在臨床沒有廣泛使用。NBT/BCIP 顯微鏡下可以由于 pH 值不同形成藍色、紫色或棕色沉淀，是堿性磷酸酶顯色的最好選擇。根據(jù)本實驗室之前經(jīng)驗來看，NBT/BCIP 的通常顯色為棕色，這和 DAB 顏色很接近不容易區(qū)分，而且常需要 30 ℃孵育 1 ~ 2 h，實驗操作時間太長，NBT/BCIP 染色組織樣本室溫放置長時間會出現(xiàn)藍色沉淀，除非片子封片后馬上掃描拍照存檔，否則藍色沉淀會影響實驗結果的判讀。也有文獻報道，DAB 經(jīng) NBT/BCIP 作用后可轉(zhuǎn)變?yōu)榛宜{色，易與 NBT/BCIP 的藍色產(chǎn)物相混淆，降低對比度[7]；也有不少文獻使用棕色和紅色的顏色結合作為免疫組化雙染的顏色結合[7-10]。我們最后選擇快紅，室溫顯色 20 min，染色完畢后，放入烘箱60 ℃ 1 h 或室溫過夜直接用中性樹脂封片，并未發(fā)現(xiàn)顏色減弱。

雙重免疫組織化學染色的關鍵在于如果是同一種屬來源的一抗，如何完全消除上一重染色中抗體及其復合物的活性，避免與下一重染色的抗體和復合物起交叉反應。以往，常常采用酸性溶液（如 pH 2.2 的甘氨酸-鹽酸溶液）來洗脫前一種染色在切片上形成的抗原抗體復合物。但在實踐中發(fā)現(xiàn)，此方法并不能完全消除交叉反應，而且酸洗還會破壞切片中組織抗原而影響下一重染色[11]?，F(xiàn)在實驗中，一抗的純度很高，不同種屬一抗混合孵育，不會造成非特異性染色，而同一種屬的一抗通過封閉液也能很好地進行封閉，避免非特異性雜交。整個實驗過程，如果是不同來源的一抗，比常規(guī)免疫組化只多了一步快紅顯色 20 min，而同一來源的一抗，也只比常規(guī)免疫組化多了 2 h。但是一張樣本可以結合2 個抗體，減少一半以上的樣本數(shù)量，也大大降低了工作量。此外，實驗中可以減少抗體稀釋液、PBS、蘇木素等試劑的消耗。

將單染和雙染結果進行對比，發(fā)現(xiàn) 32 例乳腺癌中兩者在結果判定方面沒有差別，所以說明雙染法除了在一張芯片上檢測 2 種抗原，顯示不同顏色，而且還步驟簡單，節(jié)約成本，比單染法更直觀地進行對比，更利于病變的觀察，提高診斷質(zhì)量。因此，應用雙重免疫組化技術在臨床診斷上有十分廣闊的前景。

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郜恒駿，Email：hengjun_gao@shbiochip.com

2012-11-15

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.014