四種測定纖維素酶發(fā)酵過程生物量方法的比較

李晨 赫榮琳 武改紅 馬立娟 路福平 陳樹林

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津 300308）

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系。根據(jù)纖維素酶系中各種酶組分的功能不同，纖維素酶可分為三大類：內(nèi)切葡聚糖苷酶（endo-β-1，4-glucanase，EG，EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖苷酶（exo-β-1，4-glucanase，CBH，EC3.2.1.94）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，CB，EC 3.2.1.21）。除此之外，近年來新的纖維素酶組分也不斷被發(fā)現(xiàn)。利用纖維素酶降解纖維素的優(yōu)點在于特異性高，反應條件溫和，環(huán)境污染小。隨著人們對纖維素酶分子結(jié)構(gòu)及作用機理等各方面的研究工作的深入，纖維素酶已在食品、飼料、環(huán)境保護、能源和資源開發(fā)等各個領域中發(fā)揮越來越大的作用。

現(xiàn)有的纖維素酶生產(chǎn)方法主要采用微生物液體發(fā)酵法，生產(chǎn)菌株以里氏木霉（Trichoderma reesei）及其近緣菌株應用最為廣泛［1－3]。此外，真菌纖維素酶多數(shù)是誘導酶，其合成及表達須在誘導物存在下才能進行，而廉價的纖維素類物質(zhì)作為纖維素酶液體發(fā)酵的原料其本身就是良好的誘導劑。但是，由于纖維素類物質(zhì)是不溶于水的，為檢測纖維素酶發(fā)酵過程中的生物量帶來了很大難度而發(fā)酵過程中生物量不但是生產(chǎn)中發(fā)酵工藝優(yōu)化及過程控制必需監(jiān)測的指標，同時也是過程傳質(zhì)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化及酶合成等理論研究方面的一個重要的參數(shù)［4－6]。測定菌絲體蛋白的方法［7，8]、測定核酸的方法［9]和酸洗干燥法［10，11]均被文獻報道過用來測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中的生物量，但是這幾種方法均存在各自的優(yōu)缺點。如前兩種方法均需以可溶性碳源為底物進行純培養(yǎng)以做出標準曲線，處理過程、測定步驟繁瑣，導致測定結(jié)果存在一定的誤差。后一種方法雖然簡單，但是由于酸處理后需反復洗滌沉淀以及干燥稱重本身也存在較大誤差。纖維素測定儀的方法由于受儀器本身的限制未見文獻報道應用于測定纖維素酶發(fā)酵過程中的生物量。

因此，本研究在大量測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中生物量的基礎上，分別采用測定菌絲體蛋白、測定核酸、酸洗干燥和纖維素測定儀4種方法對生物量進行分析檢測，同時在精密度、誤差分析以及影響因素等方面對幾種方法進行比較，通過對測定結(jié)果進行統(tǒng)計檢驗，綜合分析各方法的優(yōu)缺點，以期為精確、快速地測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中的生物量提供選擇方法的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 冰醋酸、濃硝酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、十水硼酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸鈉和無水磷酸氫二鈉均為實驗室常規(guī)試劑，分析純；乙二醇乙醚為有機溶劑；牛血清白蛋白（BSA）為生化試劑，購于Sigma；試驗用水為二次重蒸水。

中性洗液配制如下：將6.81 g十水硼酸鈉和18.61 g 乙二胺四乙酸二鈉放入燒杯中加熱并用蒸餾水溶解，加入30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚；同時，用蒸餾水單獨溶解4.56 g磷酸氫二鈉直至其完全溶解；將兩種溶液混合，并用蒸餾水定容至1 000 mL，控制pH 值在6.9和7.1之間。

1.1.2 儀器與設備 連續(xù)波長酶標儀（SPECTRAMAX 340PC384，美國Molecular Devices公司），纖維素測定儀（FIWE6，意大利VELP公司），離心機（SIGMA 3-18K型，德國Sigma公司），恒溫水浴鍋（XMTD-6000，北京市長風儀器儀表公司），臺式冷凍干燥機（FD-1A-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司），電熱鼓風干燥箱（DHG-9140A型，上海一恒科學儀器有限公司）。

1.1.3 樣品 試驗中分析所用樣品為采用本實驗室保藏的里氏木霉（Trichoderma reesei）Rut C-30突變株30s-3-13于5 L發(fā)酵罐發(fā)酵36 h取樣所得。

1.2 方法

1.2.1 測定菌絲體蛋白的方法 精密稱取提前以可溶性碳源為底物培養(yǎng)好的0.3 g純的干菌絲體，懸浮于裝有15 mL、0.2 mol/L NaOH的50 mL離心管中，將該懸浮液置于沸水浴中20 min后，取出離心管靜置12 h，以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，采用Bradford法測定上清液中的蛋白濃度。

取10 mL發(fā)酵液樣品于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌3次，按照上述步驟提取菌絲體蛋白，即將洗滌后的沉淀物懸浮于15 mL、0.2 mol/L NaOH中，置于沸水浴20 min后，取出靜置12 h，測定樣品上清液中的蛋白濃度。按照下式計算生物量：

式中：C1-樣品中蛋白濃度（g/L），C2-純菌體上清中蛋白濃度（g/L）。

1.2.2 測定核酸的方法 精密稱取提前以可溶性碳源為底物培養(yǎng)好的純的干菌絲0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g，分別置于裝有25 mL 5%的三氯乙酸溶液的50 mL離心管中，于80℃水浴提取25 min，同時用玻璃棒不間斷進行攪拌，取出后水浴冷卻，于4℃8 000 r/min離心15 min，將上清液進行適當稀釋，以5%三氯乙酸作為零點對照，分別于260 nm處測定吸光度，以菌體質(zhì)量為橫坐標，260 nm處吸光值為縱坐標，做標準曲線（圖1）。菌體質(zhì)量在0-0.8 g范圍內(nèi)線性關系良好，其回歸方程為y=1.2412x，R2=0.9988。其中，x為菌體質(zhì)量（g），y為OD260。

取10 mL發(fā)酵液樣品于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，沉淀于-60℃冷凍真空干燥至恒重后，采用與上述相同的處理方法，260 nm處測定吸光值。按照下式計算生物量：

1.2.3 酸洗干燥法 取10 mL發(fā)酵液樣品于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，沉淀物于-60℃真空干燥至恒重后稱重。將干燥后的沉淀懸浮于3 mL醋酸-硝酸溶劑中（150 mL 80%醋酸與15 mL純硝酸混合），置于沸水浴中30 min，冷卻后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀物用10 mL蒸餾水洗滌2－3次，于40℃減壓干燥至恒重。6個平行樣測定。按照下式計算生物量：

式中：M1為發(fā)酵液離心后底物總干重（g），M2為經(jīng)過酸處理后剩余底物的干重（g）。

1.2.4 纖維素測定儀的方法 取10 mL發(fā)酵液樣品于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，沉淀物于-60℃真空干燥至恒重后稱重，將干燥后的沉淀放入恒重好的坩堝內(nèi)，加入100 mL中性洗液，0.5 g亞硫酸鈉和幾滴辛醇，加熱至沸騰，并從沸騰開始計時，回流60 min。用沸水過濾并清洗3 次，然后用冷丙酮清洗2次。于105℃干燥8 h，放于干燥器中冷卻，稱重。按照下式計算生物量：

式中：M1為發(fā)酵液離心后底物干重（g），M2為殘渣重（g）。

2 結(jié)果

2.1 測定結(jié)果與精密度分析

采用4種方法測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵36 h后生物量的結(jié)果見表1。由表1可見，采用測定核酸的方法所測得的結(jié)果最大，生物量為16.97 g/L；酸洗干燥法和纖維素測定儀法的測定結(jié)果較為接近，生物量分別為15.74 g/L和15.6 g/L；測定菌絲體蛋白的方法所測得的結(jié)果最低，為14.28 g/L。由此可見，由于各種方法的測定過程及其影響因素不同，采用幾種方法所測得的生物量的值存在一定的差異。

同時，由表1可見，采用4種方法多次測定結(jié)果的相對標準偏差（RSD）值均在10%以內(nèi)，認為各測定結(jié)果準確有效。其中，采用測定核酸的方法結(jié)果RSD值最小，為6.32%，酸洗干燥法最大，為8.23%。由于RSD值通常用來表示分析測試結(jié)果的精密度，因此，幾種方法相比，采用測定核酸的方法來測定生物量的結(jié)果精密度最高，纖維素測定儀的方法和菌絲體蛋白法次之，酸洗干燥法最差。

表1 不同方法測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中生物量的結(jié)果

2.2 測定方法差異性檢驗

以精密度最高的核酸測定法所得的結(jié)果為標準，對其余3種方法與核酸測定法在測定結(jié)果的平均值的差異程度上進行配對t檢驗，計算公式如下［12， 13， 14]：

利用公式（5）-（7），計算得到t值結(jié)果見表2。同時，測定次數(shù)為6次，即n= 6，代入公式（8）計算得df= 5，因此，查t介值表t0.05（5）=2.571。由表2中數(shù)據(jù)可知，3種方法的t值均小于2.571，即小于t0.05（5），說明P>0.05，因此，t檢驗結(jié)果表明，這4種方法的測定結(jié)果平均值之間的差異不顯著，均可作為以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中生物量的測定方法。但是，由于核酸法具有較高的精密度，可作為較精確監(jiān)測以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中生物量變化趨勢的方法，但是，由于該方法需要以可溶性碳源為底物進行菌絲體純培養(yǎng)，從而進行換算以確定發(fā)酵過程中生物量的絕對值，導致操作步驟繁瑣，測定過程耗時較長，而酸洗干燥法和纖維素測定儀法則可代替核酸法和菌絲體蛋白法來直接測定不溶性底物纖維素的含量，同時也得到發(fā)酵過程中的生物量。

表2 不同方法測定結(jié)果的t檢驗

3 討論

測定菌絲體蛋白、酸洗干燥以及測定核酸的方法通常被文獻報道用來檢測以廉價的不可溶性纖維素底物為原料發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中的生物量。但是，幾種測定方法均存在優(yōu)缺點。本研究綜合比較了上述3種方法以及尚未見文獻報道過的纖維素測定儀的方法，從測定結(jié)果可見，采用不同方法所測得的生物量的值存在一定的差異，這可由這4種測定方法的檢測步驟來解釋。首先，核酸測定法需要先將細胞破壁，提取核酸，通過顯色反應，測定吸光度，然后結(jié)合可溶性碳源培養(yǎng)的菌體采用相同方法處理得到的標準曲線，計算得到樣品的生物量。該方法產(chǎn)生的誤差主要在細胞破壁提取核酸環(huán)節(jié)，如提取溫度、時間以及攪拌方式等均是影響細胞破壁程度的因素，進而影響生物量測定結(jié)果的準確性。同時，該方法需要提前以可溶性碳源為底物進行菌絲體純培養(yǎng)，以制定標準曲線，因此，該方法操作過程耗時較長。測定菌絲體蛋白的方法與核酸測定法的原理類似，其過程是直接采用氫氧化鈉對發(fā)酵液沉淀進行處理，溶解出菌體中的蛋白質(zhì)，測定溶解出的蛋白量，結(jié)合采用可溶性碳源為底物培養(yǎng)得到的純的菌絲體，通過一定的系數(shù)進行計算得到的生物量。采用可溶性碳源為底物培養(yǎng)所得的純菌絲體，其細胞內(nèi)的蛋白含量較以不可溶性纖維素為底物發(fā)酵所得菌絲體中的蛋白含量要低一些，因此，采用純的菌絲體作為參考，導致所測得的生物量偏低。與核酸測定法所得的結(jié)果相差2.69 g/L。

酸洗干燥法和纖維素測定儀法的測定原理類似，均是采用試劑對發(fā)酵液沉淀進行處理，以除去沉淀中的菌體，測定不溶底物纖維素的含量，然后利用總干重與底物纖維素含量的差值進行計算得到相應的生物量。因此，采用這兩種方法測得的結(jié)果相差不大，僅為0.14 g/L。在這兩種測定方法中，經(jīng)過試劑處理后，需要經(jīng)過反復的洗滌離心，部分沉淀在去上清的過程中會損失掉，造成測定結(jié)果存在一定的誤差。此外，由于沉淀以及坩堝均需干燥至恒重，以及中性洗液處理樣品需沸騰回流1 h等，使得纖維素測定儀的方法操作時間也較長。

檢測以不溶性纖維素為底物進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中的生物量，需要一個精密度高、誤差相對較小以及操作相對較為簡便的方法，由此可見，采用精密度較高的測定核酸的方法可較精確地測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中的生物量，采用精密度稍差但操作較為簡單的酸洗干燥法也可用于普通常規(guī)檢測分析，而纖維素測定儀的方法精密度高于酸洗干燥法但測定過程稍顯繁雜，其更多還是應用于測定木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的組分含量分析上，但如果需要同時較精確的直接測定底物纖維素和生物量，采用纖維素測定儀的方法是較好的選擇。由本文中對幾種方法測定結(jié)果的比較可見，文獻報道中較多采用的菌絲體蛋白法無論是在精密度上還是操作簡便性上均無優(yōu)勢可言。

4 結(jié)論

本研究通過采用4種不同的方法測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中的生物量，測定核酸的方法精密度最高，可較精確地測定以不溶性纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶過程中的生物量，酸洗干燥法精密度較差但其操作較為簡便，可用于常規(guī)監(jiān)測，而纖維素測定儀的方法可同時較精確的測定底物纖維素和生物量。菌絲體蛋白法無論是在精密度上還是操作簡便性上均不占優(yōu)勢。

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