轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子研制

李亮 王晶 臧超 隋志偉 趙正宜

（中國計量科學(xué)研究院，北京 100013）

《2011年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化態(tài)勢》（年報43）作者、ISAAA主席Clive James博士強(qiáng)調(diào)：2011年轉(zhuǎn)基因作物種植面積較2010年增長8%，即1 200萬hm2；來自全球29個國家的農(nóng)民中約有1億人次種植了轉(zhuǎn)基因作物，且累積種植面積超過12.5億hm2（超過美國或中國25%的國土面積）［1]。

中國在1997年就已經(jīng)開始有轉(zhuǎn)基因植物獲得安全證書，到目前為止已有8種植物獲批。最具備里程碑意義的是：2009年11月27日通過了對轉(zhuǎn)基因Bt水稻和植酸酶玉米的生物安全認(rèn)證，這一舉措對轉(zhuǎn)基因作物在中國、亞洲乃至全世界的應(yīng)用產(chǎn)生重大影響［2]。其中“華恢1號（TT51-1）”的獲批意味著轉(zhuǎn)基因水稻朝著水稻原產(chǎn)國和水稻消費大國——中國的商業(yè)化生產(chǎn)大門邁出了實質(zhì)性的一步。

隨著轉(zhuǎn)基因水稻的獲批，轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的定性與定量檢測隨之而來。質(zhì)粒分子具有易于富集，非植物來源，可以高效、快捷獲得無限穩(wěn)定量的優(yōu)點，同時也解決了難以獲得植物陽性基因組DNA對檢測所帶來的問題［3]。轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子（pTT51）按照國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范（JJF 1006-94）［4]進(jìn)行研制，可用于轉(zhuǎn)基因定量檢測和安全評價、實驗室質(zhì)量控制等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號種子由上海交通大學(xué)提供；pEASY-T3質(zhì)粒載體購自北京全式金公司。

1.1.2 試劑與儀器 TaqMan?Universal Master Mix購自Applied Biosystems公司；正反向引物、TaqMan探針均由Invitrogen上海公司合成；基因組提取試劑盒Wizard?Magnetic DNA Purification System for Food procedure和質(zhì)粒提取試劑盒購于Promega公司；實時熒光定量PCR儀為LightCycler?480 II；紫外分光光度計DU-800購自貝克曼公司；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)采用BioRad公司產(chǎn)品等。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒分子的制備 通過查閱轉(zhuǎn)化體的相關(guān)資料，選取華恢1號轉(zhuǎn)化體特異性（外源基因）序列，長120 bp，單拷貝［5]；選取RBE4基因片段，長106 bp，單拷貝［6]作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)化體特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列

構(gòu)建得到的質(zhì)粒pTT51-1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌受體菌JM109中，以氨芐青霉素為篩選標(biāo)記，確認(rèn)陽性克隆后在LB培養(yǎng)液中進(jìn)行大量培養(yǎng)，然后利用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取和純化。

分別采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠電泳法、紫外分光光度法判斷DNA的純度及濃度，以及選擇3家測序?qū)嶒炇襾眚炞C質(zhì)粒片段的正確性。

1.2.2 實時熒光定量PCR反應(yīng)的引物和探針 試驗共需要兩對引物和相應(yīng)的探針，引物和探針序列設(shè)計參考文獻(xiàn)［7] ，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

1.2.3 特異性檢測 為驗證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的特異性，采用不同作物轉(zhuǎn)化體的內(nèi)源、外源特異性引物分別對質(zhì)粒分子進(jìn)行擴(kuò)增。選取轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因大豆MON89788和轉(zhuǎn)基因棉花MON1445三種轉(zhuǎn)化體，分別采用內(nèi)、外源引物對3種轉(zhuǎn)化體基因組及質(zhì)粒分子進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的引物及探針序列

1.2.4 替代性研究 實時熒光定量PCR試驗時，完全依賴質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子而不使用其它標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是不可能的。問題在于質(zhì)粒和基體在定量中是否可以替代，因為不可能保證每個質(zhì)粒分子同植物基因改良樣品的拷貝數(shù)相比都產(chǎn)生11的結(jié)果，因為相關(guān)效率和轉(zhuǎn)基因作物的外源基因片段和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因片段也許發(fā)生了變化［7]。對質(zhì)粒與基體進(jìn)行可替代性研究，采用qPCR方法，即指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。采用外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增的Cq值［8]（每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)）相比的方法，通過qPCR隨機(jī)取樣進(jìn)行分析。主要考察標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率和線性擬合度（R2）。

1.2.5 均勻性分析 均勻性分析同樣采用qPCR技術(shù)，在DNA序列的固有特征一致的前提下，試驗證明批次間的序列比值沒有差異。通過組間方差和組內(nèi)方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，二者之比小于統(tǒng)計檢驗的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的［9]。

pTT51共制備了500管標(biāo)準(zhǔn)分子，每管500 μL，隨即取樣單元為15管，分別標(biāo)記1-15。15管pTT51進(jìn)行實時熒光PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.6 穩(wěn)定性檢驗 穩(wěn)定性是指在規(guī)定的時間間隔和環(huán)境條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的性質(zhì)［8]，即用來描述特性量值隨時間變化的。穩(wěn)定性分析方法：采用外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增的Cq值相比的方法，通過qPCR隨機(jī)取樣進(jìn)行分析。

1.2.7 定值和不確定度評估 定值結(jié)果通過實時熒光定量PCR方法計算Cq比值為參考值，然后對pTT51治理分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測量不確定度評估。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒

2.1.1 質(zhì)粒分子構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化體目標(biāo)DNA片段（120 bp）和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因DNA片段（106 bp）通過重疊技術(shù)構(gòu)建到載體pEASY-T3上，命名為pTT51，物理圖譜見圖1。

2.1.2 質(zhì)粒分子的純化和質(zhì)量分析 構(gòu)建得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌受體菌中，菌種保藏在-70℃冰箱，以載體氨芐青霉素（Amp）抗性為篩選標(biāo)記。質(zhì)粒的大量制備由保藏的菌種開始，首先使菌種復(fù)壯，劃平板挑取單克隆菌落在LB培養(yǎng)液中進(jìn)行大量培養(yǎng)，然后采用質(zhì)粒提取試劑盒Promega A2393進(jìn)行提取和純化。

用紫外分光光度法測定所提DNA的濃度與純度，OD260/OD280值應(yīng)在1.8-2.0之內(nèi)，OD260/OD230值應(yīng)該大于2。測定結(jié)果（表1）顯示均在要求范圍內(nèi)。

表1 pTT51質(zhì)粒分子的紫外測定結(jié)果

通過測序分析來驗證構(gòu)建質(zhì)粒片段的正確性及連入的拷貝數(shù)，采用三家實驗室的測序，即上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司、生工生物工程有限公司和北京諾賽基因組研究中心。測序結(jié)果表明連入片段與圖1一致，并且為單拷貝連入。

2.1.3 特異性檢測 選取轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因大豆MON89788和轉(zhuǎn)基因棉花MON1445三種轉(zhuǎn)化體，分別采用內(nèi)、外源引物對3種轉(zhuǎn)化體基因組及pTT51質(zhì)粒分子進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖2，圖3）顯示，pTT51內(nèi)、外源引物可擴(kuò)增出目的條帶，為陽性，而其它作物檢測結(jié)果及空白對照（NTC）為陰性，因此說明pTT51質(zhì)粒分子的內(nèi)、外源基因針對其它引物特異性良好。

2.2 替代性研究

2.2.1 PCR擴(kuò)增效率的分析評價 采用方差分析的F分布假設(shè)檢驗。一般認(rèn)為在95%的置信區(qū)間內(nèi)，取α=0.05，即臨界P值。若最后算得的P值>0.05，即在F分布的95%的區(qū)間內(nèi)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)沒有差別。若最后算得的P值<0.05，即在小概率區(qū)間內(nèi)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)有顯著性差別。

通過基因組DNA和質(zhì)粒DNA擴(kuò)增效率的比較（表2）發(fā)現(xiàn)，兩者的內(nèi)外源擴(kuò)增效率并沒有顯著的差別（P均大于0.05），說明質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增效率與基因組DNA是相似的。

表2 基因組DNA和質(zhì)粒DNA擴(kuò)增效率的比較

2.2.2 線性擬合度的分析評價 由試驗數(shù)據(jù)可知，華恢1號基體DNA和質(zhì)粒DNA的R2在0.992-1.000之間。通過基因組DNA和質(zhì)粒DNA的R2比較（表3），發(fā)現(xiàn)兩者的內(nèi)源線性擬合度和外源線性擬合度均無顯著差異（P>0.05），可以互相替代為陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行定量檢測。

表3 基因組DNA和質(zhì)粒DNA 的R2比較

通過試驗數(shù)據(jù)分析，分別對轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號基體和質(zhì)粒分子的擴(kuò)增效率和線性擬合度分別進(jìn)行了可替代性的評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基體和質(zhì)粒分子具有相似的擴(kuò)增效率和線性擬合度。在實際定量操作中可以互相替代作為陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2.3 均勻性檢驗

將外源和內(nèi)源Cq值相比后，采用F檢驗的方法對實時定量PCR所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果（表4）表明F

表4 pTT51管間均勻性分析結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性檢驗

一般短期穩(wěn)定性研究4周，長期穩(wěn)定性進(jìn)行6個月或1年。按ISO導(dǎo)則35［9]關(guān)于穩(wěn)定性評價的方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性進(jìn)行評價。

短期穩(wěn)定性分析：分別存儲在-20℃、4℃或25℃，達(dá)1、2、3、4周，各3管樣本，每管分成3個子組（N=3，n=3）。一個存儲在70℃的同種樣本做參照。每個樣本3次重復(fù)，通過qPCR對兩個序列含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 pTT51短期穩(wěn)定性統(tǒng)計結(jié)果

長期穩(wěn)定性試驗：將凍存管放置在-70℃（參照溫度），-20℃，達(dá)1、2、3、6個月進(jìn)行。3個不同的管在每個溫度下通過qPCR同時分別進(jìn)行3個重復(fù)的測試（5 μL pDNA每個PCR反應(yīng)）。數(shù)據(jù)經(jīng)格拉布斯檢驗無離群值需要剔除，已統(tǒng)計6個月，見圖9。自由度n-2=3，P=0.95，t=2.352，b1=0.0002，t*S（b1）= 0.004642，故此b1

2.5 定值

定值結(jié)果通過qPCR的方法計算Cq比值為參考值。

2.5.1 參考值的確定 將測定的pTT51質(zhì)粒分子的外源基因片段與內(nèi)源基因片段之比（n=44）的結(jié)果為0.967，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.013。

2.5.2 參考值的不確定度評定 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的參考值確定后，還要對測量結(jié)果的不確定度進(jìn)行分析?？偛淮_定度由3部分組成：第一部分是通過測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法計算出；第二部分是通過對測量影響參數(shù)和影響函數(shù)的分析估計出；第三部分是物質(zhì)不均勻性和物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動性所起的不確定度。

A類不確定度的評估（UA）：該分量是通過測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法計算出的不確定度。

B類不確定度評估（UB）：通過對測量影響因素的分析，得出B類不確定度的分量（UB）。該分量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的整個過程有關(guān)，本研究主要考慮移液器等所有過程。

移液器引入的不確定度，按照試驗方法中涉及的移液器以及所用體積。移液器帶來的不確定度主要由各種移液器的校準(zhǔn)偏差引入，包括使用到的各種量程的移液器偏差。

因此urel（v）=0.0016

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不均勻性引起的不確定度的評定（UH）：由本質(zhì)粒的研制報告可知，樣品經(jīng)均勻性檢驗后是均勻的，所以此部分的貢獻(xiàn)為：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引起的不確定度（UT）：按照ISO導(dǎo)則35的方法，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗，選取0，1，2，3，6三個月的外/內(nèi)源Cq值比值進(jìn)行計算。由于斜率變化是不顯著的。因而未觀測到不穩(wěn)定性。St=Sb·t=0.012

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度UC為：

將以上4個部分的相對不確定度合成，在擴(kuò)展因子為2時，得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

U=0.024

3 討論

植物組織的難獲取時，或者不頻繁使用標(biāo)準(zhǔn)品時，質(zhì)粒分子可以方便而迅速的獲得，并且達(dá)到檢測目的。目前市場上僅有4種質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用于檢測：轉(zhuǎn)基因玉米MON810（ERM-AD413）、轉(zhuǎn)基因玉米NK603（ERM-AD415）、轉(zhuǎn)基因大豆356043（ERM-AD425）、轉(zhuǎn)基因玉米98140（ERMAD427）。相對已經(jīng)上市的近200轉(zhuǎn)化體而言，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的市場研發(fā)前景是巨大的。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子已經(jīng)成為解決轉(zhuǎn)基因作物檢測有效性的新途徑之一。

我國轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識制度中，未設(shè)置標(biāo)識閾值。目前我國已發(fā)布的轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)大都是通過常規(guī)PCR方法進(jìn)行定性檢測，或者利用實時熒光PCR方法進(jìn)行檢測但僅做定性判斷。而在實施強(qiáng)制性標(biāo)識的大部分國家和地區(qū)，都設(shè)置了標(biāo)識閾值，并將實時熒光定量PCR方法作為轉(zhuǎn)基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)化方法。如歐盟、日本、韓國規(guī)定，對食品及飼料中轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識的閾值分別為0.9%、5%與3%，并建立了相應(yīng)的定量檢測方法。面對不斷發(fā)生的轉(zhuǎn)基因事件、針對國際轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識的現(xiàn)狀，我國迫切需要加大開展轉(zhuǎn)基因生物定量檢測技術(shù)研發(fā)的力度，建立完善、規(guī)范的定量檢測技術(shù)體系，并在此基礎(chǔ)上加快開展定量檢測標(biāo)準(zhǔn)的研制。

4 結(jié)論

本研究嚴(yán)格按照國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備，通過qPCR的方法計算Cq比值為參考值，結(jié)果為0.967。經(jīng)不確定度評價，pTT51質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度為0.024，可以替代基因組作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于實驗室質(zhì)控、含量檢測及貿(mào)易爭端等領(lǐng)域。

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