開(kāi)口箭甲醇提取物抗氧化和抑菌活性研究

石宛平，張怡軒，林奇泗，2，王淼，王慧，趙春杰，*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 徐州 221004）

中藥開(kāi)口箭別名牛尾七、巖七，為百合科鈴蘭族開(kāi)口箭屬植物開(kāi)口箭Tupistra chinensis Bak.，以根狀莖入藥[1]。夏秋二季采挖，除去須根，洗凈，曬干。主要分布于湖北、江西、福建、安徽、河南、陜西、四川、云南、廣西，生于林下陰濕處，溪邊和路旁，海拔1 000 m～2 000 m[2]。其味甘，微苦。有毒。具有清熱解毒，散瘀止痛。用于白喉，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，腰腿疼，跌打損傷，毒蛇咬傷；外用治癰癤腫毒[3]。

開(kāi)口箭的醇提物對(duì)咽喉部常見(jiàn)致病菌如金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌等有較好的體外抑菌作用[4]。本文采用圓盤擴(kuò)散法比較了開(kāi)口箭醇提取物的對(duì)2 種細(xì)菌和2 種真菌的抑制活性。至2013 年1 月1日為止，鮮見(jiàn)對(duì)開(kāi)口箭提取物的抗氧化活性研究報(bào)道?？寡趸钚缘臋C(jī)制較為復(fù)雜，應(yīng)采用一種以上方法對(duì)藥物的抗氧化研究[5]。本文對(duì)開(kāi)口箭醇提取物進(jìn)行抗氧化活性的研究，并比較開(kāi)口箭醇提取物中石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層和正丁醇層的抗氧化活性，為進(jìn)一步探討開(kāi)口箭藥理作用打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：浙江省嘉興市俊思儀器設(shè)備廠；HH-3 數(shù)顯恒溫油浴鍋：江蘇金壇市江南儀器廠；SC-97 自動(dòng)三重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；BS110 電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1700 型可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)：日本SHIMADZU公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 材料與試劑

無(wú)水硫酸鈉（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制三重蒸餾水；甲醇、乙醇（95%）、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和二甲基亞砜：均為分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；2，4，6-反式2-吡啶基三嗪（TPTZ）、維生素C（VC）：上海阿拉丁試劑有限公司；開(kāi)口箭藥材：鵬翔藥業(yè)，批號(hào)90021，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院賈景明教授鑒定，為百合科開(kāi)口箭屬植物開(kāi)口箭Tupistra chinensis Bak.的根狀莖，將開(kāi)口箭藥材粉碎，過(guò)二目篩，貯于干燥器中備用。

1.2.2 供試菌種

大腸埃希氏菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、白色念珠菌（ATCC26970）和新型隱球菌（ATCC9763）：由沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院提供。細(xì)菌菌株在37 ℃下Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)24 h，真菌在30 ℃下馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）中培養(yǎng)72 h。

2 方法

2.1 開(kāi)口箭提取物制備

2.1.1 開(kāi)口箭甲醇提取物制備

取開(kāi)口箭粉末約10 g，加入甲醇150 mL 索氏提取6 h。提取液濾過(guò)后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度50 ℃）濃縮干燥，得深棕色浸膏備用。

2.1.2 開(kāi)口箭不同萃取溶液制備

取根據(jù)2.1.1 制得的開(kāi)口箭浸膏，加入100 mL 蒸餾水溶解，分別依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3 次。合并石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取液，并濃縮至干，放至冰箱冷藏備用。

2.1.3 TPTZ 工作液的配制

將2.5 mL 20 mmol/L FeCl3·6H2O，2.5 mL 10 mmol/L TPTZ（以40 mmol/L 鹽酸溶解），25 mL 0.3 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH3.6），臨用前混合。

2.2 開(kāi)口箭抑菌活性研究

2.2.1 抑菌活性研究

通過(guò)圓盤擴(kuò)散法[6]進(jìn)行開(kāi)口箭抑菌活性研究，將由2.1 制得的開(kāi)口箭的醇提浸膏溶解在2%的二甲基亞砜中制成最終濃度為40 mg/mL 的溶液，通過(guò)0.2 μm的微孔濾膜過(guò)濾，滅菌備用。將含有細(xì)菌108 CFU/mL和真菌106 spore/mL～107 spore/mL 的滅菌生理鹽水300 μL 分別均勻涂在Luria-Bertan（iLB）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上。將30 μL 的開(kāi)口箭醇提取液和2%的DMSO（作為陰性對(duì)照）浸漬在直徑6 mm 的濾紙片上，將浸漬好的濾紙片放在被接種的瓊脂上。接種細(xì)菌菌株的培養(yǎng)皿在37 ℃下培養(yǎng)24 h，接種真菌菌株的培養(yǎng)皿在30 ℃下培養(yǎng)72 h。用抑制區(qū)的直徑來(lái)衡量抗菌活性的大小。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)兩次。

2.2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定[7]

將開(kāi)口箭的醇提取物溶解在2%的DMSO 中，用二倍稀釋法稀釋并添加到各種供試菌的菌懸液。對(duì)于真菌實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)皿在30 ℃培養(yǎng)72 h；對(duì)于細(xì)菌實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)皿在37 ℃培養(yǎng)24 h。以沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 對(duì)DPPH 自由基的清除作用[8]

將由2.1.1 制得的開(kāi)口箭醇提物及由2.1.2 制得的4 種溶劑萃取物用95 %乙醇溶解并配制為一系列不同濃度受試樣品乙醇液。分別取2.0mL 待測(cè)液與2.0mL 0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液混合，振搖均勻后放于暗處?kù)o置30 min，于518 nm 處測(cè)定吸光度（A）i。同時(shí)測(cè)定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（A）j，以及2.0 mL 待測(cè)液與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（AC），加樣情況見(jiàn)表1。

表1 DPPH 試驗(yàn)反應(yīng)液試劑組成與體積Table 1 Compositions and volumes of DPPH assay

按式（1）計(jì)算清除率，每樣測(cè)定3 次并取平均值。以維生素C 水溶液的標(biāo)準(zhǔn)溶液為陽(yáng)性對(duì)照。再根據(jù)不同濃度樣品的清除率作曲線求出半清除率（EC50）。

2.3.2 FRAP 法測(cè)定總抗氧化能力[9]

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別取不同質(zhì)量濃度的FeSO4溶液50 μL，各加入3.0 mL 2.1.3 項(xiàng)下配制的TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，測(cè)定597 nm 處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品總抗氧化能力的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取樣品溶液50 μL，加入3.0 mL TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，測(cè)定597 nm 處的吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 開(kāi)口箭甲醇提取物對(duì)4 種病原菌的抑菌活性

開(kāi)口箭甲醇提取物對(duì)四種病原菌的抑菌圈大小及最小抑菌濃度見(jiàn)表2。

表2 開(kāi)口箭甲醇提取物的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activity of the methanol extracts from Tupistra chinensis

由表2 可知，開(kāi)口箭甲醇提取物對(duì)細(xì)菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）的抑制效果明顯，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最好，但對(duì)真菌（白色念珠菌和新型隱球菌）的抑制作用不明顯。

3.2 開(kāi)口箭提取物抗氧化活性測(cè)定

3.2.1 對(duì)DPPH 自由基的清除作用

不同極性溶劑萃取開(kāi)口箭萃取得率存在較大的區(qū)別，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 四種溶劑萃取結(jié)果Table 3 Yields of four fractions of Tupistra chinensis

分別測(cè)出開(kāi)口箭一系列不同濃度甲醇提取物吸光度Ai，Aj，AC，根據(jù)公式（1）計(jì)算出其相應(yīng)的自由基清除率。本研究以維生素C（VC）為對(duì)照，測(cè)定開(kāi)口箭甲醇提取物的濃度-清除率曲線，濃度以mg（生藥量）/mL計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 開(kāi)口箭甲醇提取物DPPH 清除率測(cè)定結(jié)果Fig.1 DPPH radical scavenging activities of the methanol extract from Tupistra chinensis

從圖1 可看出，自由基清除率隨著加入量的增加而增加，但隨著抗氧劑濃度的增加，其捕獲的DPPH 自由基也越多，逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)，變化也逐漸趨于緩慢。開(kāi)口箭甲醇提取物的抗氧化活性略強(qiáng)于維生素C。

半清除率指清除率為50%時(shí)所需樣品的濃度，所需濃度越低，表明半清除率越高。根據(jù)不同濃度樣品的清除率作曲線求出半清除率（EC50），濃度以mg 生藥量/mL 計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)比較了開(kāi)口箭石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的半清除率（EC50），結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 開(kāi)口箭四種萃取物半清除率比較Fig.2 EC50s of the 4 fractions of Tupistra chinensis

由圖2 可知，開(kāi)口箭醇提取物對(duì)DPPH 自由基有良好的清除作用。開(kāi)口箭醇提取物各層對(duì)DPPH 自由基的清除能力次序?yàn)椋洪_(kāi)口箭石油醚層<開(kāi)口箭乙酸乙酯層<開(kāi)口箭氯仿層<開(kāi)口箭正丁醇層。

3.2.2 FRAP 法測(cè)定總抗氧化能力

實(shí)驗(yàn)確定了以FeSO4為對(duì)照品的總還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.195x+0.003（r=0.999 2）。由此得出開(kāi)口箭甲醇提取物的FRAP 值為（0.196±0.007）mmol/g。而開(kāi)口箭石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的FRAP 平均值分別為1.85×10-3、1.38×10-2、1.30×10-2和1.46×10-2mmol/g，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 開(kāi)口箭四種萃取物FRAP 值Fig.3 FRAP value of the 4 fractions of Tupistra chinensis

開(kāi)口箭醇提取物各層的抗氧化能力次序?yàn)椋洪_(kāi)口箭石油醚層<開(kāi)口箭乙酸乙酯層<開(kāi)口箭氯仿層<開(kāi)口箭正丁醇層。與對(duì)DPPH 自由基的清除能力一致。

4 結(jié)論

本研究表明開(kāi)口箭甲醇提取物具有一定的抑菌活性。開(kāi)口箭甲醇提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌這兩種細(xì)菌的抑制效果明顯，但對(duì)白色念珠菌和新型隱球菌這兩種真菌的抑制作用不明顯。開(kāi)口箭不同溶劑萃取物的抗氧化活性，在一定的濃度范圍內(nèi)都呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，即提取物的濃度越大，抗氧化活性越高。其中石油醚萃取物的抗氧化活性最弱，而氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的抗氧化活性較強(qiáng)。開(kāi)口箭是一種具有廣闊開(kāi)發(fā)前景的中藥材。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，開(kāi)口箭還具有抗炎[10]及抗腫瘤[11]的作用，對(duì)開(kāi)口箭的藥品開(kāi)發(fā)和綜合利用還有待于進(jìn)一步研究。

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