乙草胺對(duì)玉米中谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)作用

陶 波，胡阿曼

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

乙草胺（Acetochlor）是美國(guó)孟山都公司于1971年開(kāi)發(fā)成功的一種芽前選擇性除草劑[1]。主要用于大豆、棉花、花生、玉米等作物防除一年生禾本科雜草及部分小粒種子闊葉雜草[2]。由于乙草胺具有殺草譜廣、價(jià)格較低優(yōu)點(diǎn)，在全國(guó)應(yīng)用廣泛。雖然乙草胺廣泛用于玉米田，但乙草胺過(guò)量使用對(duì)玉米產(chǎn)生嚴(yán)重藥害。目前，國(guó)外生產(chǎn)的乙草胺都加入安全劑來(lái)保護(hù)作物，減少作物遭受危害，從而解決乙草胺藥害問(wèn)題，而我國(guó)大多省份所用乙草胺均未加入相應(yīng)的安全劑。因此，研究乙草胺對(duì)玉米的敏感性和乙草胺誘導(dǎo)玉米體內(nèi)谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S－transferases，GST）產(chǎn)生抗除草劑作用具有重要意義。谷胱甘肽（GSH）是一種抗氧化劑，它在植物脫毒和維持氧化還原緩沖液中起重要作用[2－3]。GSH自身并不能起到脫毒作用，必須在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）催化下，才能與有毒物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為無(wú)害或低毒物質(zhì)[4－5]。國(guó)內(nèi)外研究表明，玉米品種對(duì)乙草胺的敏感性存在顯著差異，因乙草胺誘導(dǎo)不同玉米體內(nèi)產(chǎn)生的GSH含量和GST活性不同。乙草胺在玉米體內(nèi)主要降解反應(yīng)是軛合作用，通常在玉米體內(nèi)，乙草胺在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）催化下迅速與谷胱甘肽（GSH）進(jìn)行軛合反應(yīng)，使乙草胺喪失活性[6－9]。陶波等研究表明，在植物發(fā)育期除草劑能夠誘導(dǎo)GST表達(dá)[10－11]。利用浸種處理方法誘導(dǎo)玉米高量GSH和GST未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)驗(yàn)證在除草劑乙草胺浸種處理下能否誘導(dǎo)出玉米中GSH含量和GST活力，研究GST活性的誘導(dǎo)因子[12－15]，為明確乙草胺在玉米中的作用機(jī)制、培育具有抗逆及抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物和提高玉米田中使用乙草胺安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試玉米品種：Lx347（自交系）、P138（自交系）、東青1號(hào)（雜交種）、東農(nóng)0701B（雜交種），以上品種均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米教研室提供。

1.2 供試藥劑

1.2.1 除草劑

乙草胺（Acetochlor，孟山都公司生產(chǎn)，90%禾耐斯）。

1.2.2 供試試劑

5%TCA；10 mmol·L－1DTNB（溶于 0.5 mol·L－1pH 8磷酸緩沖液配制）；酶提取液（0.1 mol·L－1pH 6.5磷酸鉀緩沖液內(nèi)含5%聚乙烯吡咯烷酮及1 mmol·L－1偏重亞硫酸鈉）；3.0 mmol·L－1谷胱甘肽（溶于0.1 mol·L－1pH 6.5磷酸鉀緩沖液）；20 mmol·L－1溶于96%乙醇的CDNB。

1.3 方法

1.3.1 玉米的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

將精選玉米種子用60℃左右溫水浸泡30 min（加熱至60℃后拿出水浴鍋，將種子置于水中），再用0.6%多菌靈浸泡30 min，用蒸餾水沖洗干凈，分別用乙草胺（濃度為10、20、40、60 mg·L－1）浸種12 h左右，再用蒸餾水清洗干凈，放在溫度27℃、濕度75%的培養(yǎng)箱內(nèi)，催芽24 h左右。

將干凈的玻璃板上平鋪一張與平板相同大小的濕潤(rùn)濾紙，選擇同一處理的玉米種子10粒，臍部朝下，均勻擺放平板上，再在種子上面覆蓋一層濕潤(rùn)濾紙，將平板垂直放置在水槽中，每個(gè)處理重復(fù)3次，將水槽放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（溫度27℃、濕度75%、光照8 h，黑暗各16 h循環(huán)培養(yǎng)）。每天向水槽中加水，保持水位一致，當(dāng)玉米生長(zhǎng)7 d后，測(cè)定玉米GSH含量和GST活力。

1.3.2 GSH含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，參照采用Ellman原理，用磷酸緩沖液配制 500 μg·mL－1GSH 母液，分別取 0、 5、 25、 50、 100、 150、 200、 250、 500、1 000 μL，各加入5%TCA，分別向配好的系列標(biāo)準(zhǔn)液加入適量DTNB顯色，20℃水浴5 min使其充分顯色，在412 nm下測(cè)定OD值。

分別取玉米植株的根、莖、葉各0.2 g，加5%TCA，在0～4℃下研磨，放入離心管中離心（15 000 g）20 min，取部分離心后的上清液放入試管，加入pH 8.0磷酸緩沖液，再加入DTNB顯色，20℃水浴5 min使其充分顯色，然后在412 nm下測(cè)定OD值。

1.3.3 GST活性測(cè)定

應(yīng)用Habig和陶波方法[4]，并稍作改進(jìn)，分別取玉米植株的根、莖、葉各0.2 g，加入酶GST提取液，在0～4℃下研磨，放入離心管中離心（15 000 g）20 min，上清液為待測(cè)酶液。取出待測(cè)酶液，向待測(cè)酶液中加入pH 6.5磷酸鉀緩沖液，最后加入溶于96%乙醇的CDNB，340 nm反應(yīng)5 min，每隔1 min測(cè)定OD值。

式中，ΔA340 nm為每分鐘光吸收的變化值，V為酶促反應(yīng)體積，ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)（0.0096 L·μmol－1·cm－1），L為比色杯光程（1 cm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙草胺對(duì)玉米不同品種生長(zhǎng)發(fā)育的影響

如表1所示，不同玉米品種對(duì)乙草胺的敏感性不同，同一玉米品種苗和根的敏感性也不同，敏感性與乙草胺濃度具有顯著的相關(guān)性。按照株高抑制率GR50（抑制株高50%的值，即抑制中濃度）從大到小為：Lx347、P138、東青1號(hào)、東農(nóng)0701B。由此可知，對(duì)乙草胺的敏感性從低到高為：Lx347、P138、東青1號(hào)、東農(nóng)0701B，自交系Lx347和P138比雜交種東青1號(hào)和東農(nóng)0701B的抗性高，并且根長(zhǎng)與株高GR50趨勢(shì)相同，但是株高的GR50明顯低于根長(zhǎng)GR50，因此株高對(duì)乙草胺敏感高于根長(zhǎng)。

表1 乙草胺對(duì)不同玉米品種株高和根長(zhǎng)的敏感性Table 1 Sensibility of acetochlor on plant height and root length of different maize varieties

2.2 乙草胺對(duì)玉米谷胱甘肽（GSH）的影響

2.2.1 不同濃度乙草胺對(duì)玉米谷胱甘肽（GSH）含量的影響

圖1 不同濃度乙草胺對(duì)玉米葉片GSH含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of acetochlor on GSH content of maize leaves

從圖1可以看出，對(duì)四種玉米品種葉片中GSH含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，隨著乙草胺處理劑量的增加對(duì)不同玉米品種葉片的GSH含量影響不同，在低濃度時(shí)隨著濃度的增高GSH含量增加，其中在40 mg·L－1時(shí)各品種GSH含量增長(zhǎng)率達(dá)到最高，在60 mg·L－1GSH含量增長(zhǎng)率開(kāi)始下降。在乙草胺40 mg·L－1誘導(dǎo)下，不同玉米品種GSH含量的增長(zhǎng)率有明顯差異，Lx347品種增長(zhǎng)率達(dá)到26.32%，其他品種增加幅度不明顯，增長(zhǎng)率最小為東農(nóng)0701B。由此可知，乙草胺對(duì)玉米的敏感性與玉米體內(nèi)GSH含量有關(guān)。

2.2.2 乙草胺對(duì)玉米各部位谷胱甘肽（GSH）含量的影響

圖2為乙草胺濃度為40 mg·L－1浸種誘導(dǎo)，結(jié)果表明，不同品種GSH含量有明顯差異，同一品種各部位GSH含量增長(zhǎng)率也明顯不同，對(duì)葉部的誘導(dǎo)作用大于莖部和根部，其中Lx347葉部GSH增長(zhǎng)率最高，是其他玉米品種的1倍左右。根部GSH含量的增加幅度不大，東農(nóng)0701B品種根部基本沒(méi)有受到誘導(dǎo)作用。由此可知，乙草胺對(duì)玉米葉部GSH含量產(chǎn)生影響最為明顯，這同玉米根長(zhǎng)比株高對(duì)乙草胺敏感相對(duì)應(yīng)，并且進(jìn)一步說(shuō)明玉米對(duì)乙草胺的敏感性與玉米葉的GSH含量有關(guān)。

圖2 乙草胺對(duì)玉米各部位GSH含量的影響Fig.2 Effect of acetochlor on GSH content of maize varieties parts

2.3 乙草胺對(duì)不同玉米品種GST活性的影響

2.3.1 不同濃度乙草胺對(duì)玉米谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活性的影響

圖3 不同濃度乙草胺對(duì)玉米葉片GST活性的影響Fig.3 Effect of different concentrations of acetochlor on GST activity of maize leaves

由圖3可知，不同濃度乙草胺浸種處理對(duì)玉米葉部GST比活力有明顯影響，且呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，不同乙草胺處理劑量下，各品種GST活性有顯著差異，其中在40 mg·L－1時(shí)各品種GST比活力增長(zhǎng)量達(dá)到最高，在60 mg·L－1時(shí)，GST比活力增長(zhǎng)量開(kāi)始下降，并且對(duì)乙草胺敏感的東農(nóng)0701B GST比活力呈負(fù)增長(zhǎng)現(xiàn)象。這種規(guī)律與試驗(yàn)測(cè)得的GSH含量增長(zhǎng)規(guī)律相同。因此，乙草胺對(duì)玉米的敏感性和乙草胺誘導(dǎo)玉米體內(nèi)的GSH和GST產(chǎn)生抗除草劑作用相關(guān)。GSH通過(guò)GST催化與乙草胺產(chǎn)生軛合反應(yīng)，因此玉米體內(nèi)GSH含量和GST活性是影響玉米對(duì)乙草胺敏感性不同的原因。

2.3.2 乙草胺對(duì)玉米各部位谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）的影響

結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4為乙草胺濃度為40 mg·L－1浸種誘導(dǎo)，結(jié)果表明，同一品種各部位GST比活力增長(zhǎng)率也明顯不同，對(duì)葉部GST比活力的誘導(dǎo)效果最為明顯，誘導(dǎo)作用大于根部和莖部。其中GST比活力增長(zhǎng)最高的Lx347品種葉部增長(zhǎng)率可達(dá)83.3%，是東農(nóng)0701B葉部GST比活力的7倍。根部和莖部GST比活力增幅不大，Lx347品種葉部GST比活力是東農(nóng)0701B根部比活力的83倍。由此可知，乙草胺對(duì)玉米葉部GST比活力誘導(dǎo)效果最為明顯，這與玉米根長(zhǎng)比株高對(duì)乙草胺敏感相對(duì)應(yīng)，試驗(yàn)測(cè)定玉米葉部GSH含量增長(zhǎng)量高于其他部位相同。

圖4 乙草胺對(duì)玉米各部位GST比活力的影響Fig.4 Effect of acetochlor on GST activity of maize varieties parts

3 討論

大量研究表明，乙草胺對(duì)玉米體內(nèi)抗除草劑酶（GST）的誘導(dǎo)作用明顯。研究表明，不同玉米組織部位的GST活性具有顯著差異[8－9]。李美等曾提出自交系對(duì)乙草胺的敏感性低[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同玉米品種對(duì)乙草胺的敏感性不同，自交系比雜交種抗性高。這一結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，但是與金益提出的玉米雜種優(yōu)勢(shì)結(jié)果[17]不同，這可能是由于玉米雜交種不一定具有雜種優(yōu)勢(shì)，反而自交系能夠穩(wěn)定遺傳。因此，在使用除草劑乙草胺除草的區(qū)域，應(yīng)選擇對(duì)乙草胺耐藥性較高的玉米品種進(jìn)行種植，如Lx347自交系，提高玉米品種對(duì)乙草胺耐藥性，減輕乙草胺對(duì)玉米造成的藥害損失。

有學(xué)者提出玉米對(duì)乙草胺耐受程度不同是由于玉米體內(nèi)谷胱甘肽含量和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性不同引起的[4]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）能夠催化谷胱甘肽（GSH）與有毒物質(zhì)發(fā)生軛合反應(yīng)達(dá)到脫毒、抗逆和抗除草劑目的。本研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度的乙草胺能有效促進(jìn)玉米產(chǎn)生大量GSH和GST，并且不同玉米品種GSH含量增長(zhǎng)率和GST比活力增長(zhǎng)率有明顯差異。對(duì)乙草胺安全性高的品種GSH含量增長(zhǎng)量和GST比活力增長(zhǎng)量都相對(duì)較高。這一結(jié)果說(shuō)明了不同玉米品種對(duì)乙草胺敏感性不同的原因。綜上所述，適量濃度乙草胺誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生的大量GSH和GST能夠使玉米抵御外界不良環(huán)境和其他傷害。這一發(fā)現(xiàn)也為某些化學(xué)誘導(dǎo)劑提高植物的抗逆性和抗除草劑性能奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過(guò)生物化學(xué)方法，測(cè)定乙草胺誘導(dǎo)后玉米的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)、各部位GSH含量和GST比活力。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同玉米品種對(duì)乙草胺的敏感性不同，雜交種東農(nóng)0701B玉米品種敏感性最高，自交系Lx347玉米品種敏感性最低。在乙草胺不同濃度誘導(dǎo)下，玉米體內(nèi)GSH含量和GST比活力增長(zhǎng)量有顯著差異，誘導(dǎo)濃度為40 mg·L－1時(shí)，各品種不同部位GSH含量和GST比活力都達(dá)到最大值，葉部增長(zhǎng)量顯著高于根部和莖部。

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