評(píng)價(jià)自身抗體聯(lián)合檢測(cè)在診斷自身免疫性疾病中的應(yīng)用

孫善會(huì) 鄭 燕* 張茂修

(山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷中心，山東 濟(jì)南 250013)

評(píng)價(jià)自身抗體聯(lián)合檢測(cè)在診斷自身免疫性疾病中的應(yīng)用

孫善會(huì) 鄭 燕* 張茂修

(山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷中心，山東 濟(jì)南 250013)

目的 探討檢測(cè)抗核抗體（ANA）核型與抗可提取性核抗原(ENA)抗體及抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體之間的相關(guān)性，提高對(duì)自身免疫性疾病(AID）的診斷及鑒別診斷參考價(jià)值。方法 資料來源門診及住院的AID病例血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，ANA檢測(cè)采用間接免疫熒光法（IIF），抗ENA抗體檢測(cè)采用歐蒙斑點(diǎn)法（抗nRNP/Sm、Sm、SSA/Ro、SSB/Lo、Scl-70和Jo-1）六項(xiàng)抗體及抗(ds-DNA)抗體采用ELISA法檢測(cè)。結(jié)果 在98例ANA陽性病例血清標(biāo)本中核型分布為：細(xì)胞核均質(zhì)型(36.74%)，細(xì)胞核顆粒型(41.84%)，細(xì)胞核仁型(11.22%)，細(xì)胞核膜型(1.02%)，細(xì)胞核著絲點(diǎn)型(1.02%)；重疊核型中細(xì)胞核均質(zhì)型/細(xì)胞核顆粒型(2.04%)，細(xì)胞核均質(zhì)型/細(xì)胞漿顆粒型（6.12%）等。98例ANA與ENA同時(shí)陽性血清標(biāo)本中42例抗雙鏈DNA抗體陽性(42.86%)。36例均質(zhì)型陽性樣本中抗SSA/Ro抗體(24.48%)，抗SSB/Lo抗體(6.12%)，抗nRNP/Sm抗體(6.12%)。41例細(xì)胞核顆粒型陽性樣本抗nRNP/Sm抗體(19.39%)，SSA/Ro抗體(15.31%)，抗SSB/Lo抗體(6.12%)。ANA陽性可出現(xiàn)一種或多種自身抗體。結(jié)論 ANA常見核型有：細(xì)胞核顆粒型，細(xì)胞核均質(zhì)型及細(xì)胞核仁型。ANA均質(zhì)型核型檢出的抗ds-DNA抗體為主，且抗ds-DNA抗體含量與熒光強(qiáng)度成正比。ANA核型與抗ENA抗體二者之間有一定的相對(duì)應(yīng)性。ANA及核型、抗ENA抗體和抗ds-DNA抗體的聯(lián)合檢測(cè)可明確診斷AID，而且利于判斷患者血清中各種自身抗體與臨床表現(xiàn)的關(guān)系。

抗核抗體；抗ENA抗體；抗雙鏈DNA抗體；間接免疫熒光法；細(xì)胞核型

ANA主要用于AID的篩查。ANA所針對(duì)的靶抗原包括細(xì)胞的全部成分。隨著對(duì)特異性抗體的認(rèn)識(shí)，從只檢測(cè)總抗體逐步過渡到針對(duì)抗原蛋白分子表位靶位點(diǎn)的特異性抗體檢測(cè)。AID血清中可檢測(cè)出多種特異自身抗體，目前臨床多以ANA、抗ENA抗體和抗抗ds-DNA抗體聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用較多的項(xiàng)目，抗ENA抗體又稱鹽水可提取性核抗原抗體屬于抗核抗體，ENA是細(xì)胞內(nèi)許多小分子的RNA和多肽組成的非組蛋白的酸性核蛋白顆粒，主要有六種：抗nRNP抗體（抗核內(nèi)的核糖核蛋白抗體）、抗Sm抗體（核內(nèi)小核糖體蛋白抗體）、抗SSA/Ro抗體、抗SS-B/La抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體?？筪sDNA抗體又稱抗脫氧核糖核酸抗體,其反應(yīng)座位點(diǎn)位于DNA脫氧核糖磷酸框架上。本組病例對(duì)2008年10月至2009年12月在本院門診和住院病例ANA陽性樣本的測(cè)試結(jié)果在AID疾病中進(jìn)行分析，探討ANA特異性熒光模式與抗ENA抗體及抗ds-DNA抗體之間的相對(duì)應(yīng)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2008年10月至2009年12月我院門診及住院病例。AID患者ANA陽性98例，其中男性6例，女性92例，年齡15～83歲，平均年齡48.40歲。

1.2 試劑與步驟

1.2.1 ANA檢測(cè)

ANA間接免疫熒光法（IIF），德國歐蒙公司試劑。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格試劑操作說明書，血清稀釋1∶100后，取25μL血清與包被HEp-2細(xì)胞及大鼠肝組織生物載片室溫（18～25℃）反應(yīng)30min。磷酸鹽吐溫緩沖液沖洗反應(yīng)板，緩沖液再浸泡5 min。加FITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白（熒光二抗）20μL。室溫育30min，再同上法磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌浸泡，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察Hep-2細(xì)胞和大鼠肝組織,此時(shí)熒光素標(biāo)記的抗人抗體與結(jié)合在生物基質(zhì)上的抗體反應(yīng)，形成在熒光顯微鏡下觀察到的特異性的熒光模型。特異性染色熒光在Hep-2及大鼠肝細(xì)胞中顯現(xiàn)為陽性。無熒光可判斷為陰性，陽性病例根據(jù)著色位置判斷反應(yīng)區(qū)熒光染色核型。

表2 98例ANA陽性病例中抗ds-DNA抗體陽性分布

表3 98例ANA與抗ENA抗體陽性病例分布

表4 抗ds-DNA抗體陽性與抗ENA抗體陽性病例分布

1.2.2 抗ENA抗體測(cè)定

德國歐蒙公司試劑。根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該歐蒙斑點(diǎn)法檢測(cè)六種人抗nRNP/Sm．Sm、SSA/Ro、SSB/Ro、Scl-70和Jo-1特異抗體的體外定性檢測(cè)，載片上2條實(shí)驗(yàn)?zāi)l上平行包被了經(jīng)親和層析純化的六種抗原。第一次溫育將患者標(biāo)本血清1∶100稀釋后的稀釋血清50μL加入反應(yīng)板中與膜條上的抗原結(jié)合反應(yīng)，血清中特異性的IgG抗體可與相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合。為充分結(jié)合反應(yīng)在300rpm旋轉(zhuǎn)搖床上室溫溫育30min。緩沖液沖洗后反應(yīng)板后加入堿性磷酸酶酶標(biāo)抗人IgG進(jìn)行下一步放置溫育30min，再一次沖洗后加入顯色底物液以產(chǎn)生反應(yīng)顯色?？捎^察到包被各抗原條帶著色變化，反應(yīng)顯色者為陽性。比對(duì)固定包被顯色位置，對(duì)特異抗體陽性做出判斷。

1.2.3 抗ds-DNA抗體檢測(cè)

采用愛爾蘭Trinity Biotech公司試劑的ELISA法。執(zhí)行操作規(guī)程。1∶20倍血清稀釋后。每個(gè)微孔中加入100μL稀釋的血清標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品，室溫30min，然后每反應(yīng)空中加入300μL緩沖液洗滌5次，第二步加入酶標(biāo)二抗100μL。室溫反應(yīng)30min，再緩沖液洗滌5次。加入顯色底物液100μL，反應(yīng)時(shí)間10min后混入終止液100μL，規(guī)定時(shí)間內(nèi)酶標(biāo)儀含（450nm吸光度值）測(cè)定。結(jié)果判定：比值是標(biāo)本OD值/(標(biāo)準(zhǔn)液平均OD值×校正因子)，陰性值≤0.9，陽性值≥1.1，可疑值0.91～1.09。

1.3 儀器

熒光顯微鏡觀察ANA 熒光模型Olympus BX60型顯微鏡，激發(fā)濾片：488nm，分光濾片510nm，阻擋濾片520nm。光源：100W汞燈。酶標(biāo)儀(美國Bio．Rad公司)在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 98例ANA陽性病例血清中，細(xì)胞核型分布見表1。ANA核型細(xì)胞核顆粒型(41例，41.84%)，ANA核型細(xì)胞核均質(zhì)型(36例，36.74%)，ANA核型細(xì)胞核仁型(11例，11.22%)，ANA核型細(xì)胞核膜型(1例，1.02%)，ANA核型細(xì)胞核著絲點(diǎn)型(1例，1.02%)，細(xì)胞核均質(zhì)型重疊細(xì)胞核顆粒型(2例，2.04%) ，細(xì)胞核均質(zhì)型重疊細(xì)胞漿顆粒型（6例，6.12%）等。唯一細(xì)胞核型可出現(xiàn)，亦有兩種或兩種以上核型重疊同一病例中。常見ANA核型陽性率最多的為核顆粒型，其次為均質(zhì)型和核仁型。

表1 98例ANA陽性核型分布

2.2 98例ANA陽性病例血清中ds-DNA抗體陽性分布見表2。42例抗ds-DNA抗體陽性(42/98，42.86%)。該組ANA、抗dsDNA抗體同時(shí)陽性樣本中均質(zhì)型(21/42，50%)，細(xì)胞核顆粒型(20/42，47.62%)。

2.3 98例ANA與抗ENA抗體均陽性見表3?？笶NA抗體中抗SS-A/Ro抗體（54例，55.11%），抗SS-B/La抗體（16例，16.32%），抗nRNP/ Sm抗體（27例，27.55%），抗Scl-70抗體(1例，1.02%)，抗Jo-1抗體（0例）。ANA核顆粒核型，抗nRNP/Sm抗體檢出率最高。

2.4 表4中抗ds-DNA抗體與抗ENA抗體分布分析。ds-DNA陽性時(shí)，抗ENA抗體可唯一出現(xiàn)或兩種以上特異自身抗體出現(xiàn)，抗SSA/Ro陽性率最高。

3 討 論

AID篩查首選是ANA檢測(cè)，而IIF檢測(cè)ANA是經(jīng)典方法，可檢測(cè)到整個(gè)細(xì)胞熒光染色模型，即ANA自身抗體的核型，這對(duì)AID的診斷不可或缺[1]ANA從抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體的檢測(cè)，擴(kuò)展為檢測(cè)整個(gè)細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞分裂周期等成分[2]。IIF的ANA檢測(cè)優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)到廣義的ANA，衛(wèi)生部臨檢中心核型分為：細(xì)胞核均質(zhì)型、細(xì)胞核顆粒型、細(xì)胞核核仁型、細(xì)胞核核膜型、細(xì)胞核著絲點(diǎn)型、細(xì)胞漿胞漿顆粒型及細(xì)胞漿胞漿纖維型等核型。試劑選擇通過2種抗原基質(zhì)HEp-2細(xì)胞和大鼠肝組織的特異染色分布的觀察，更能準(zhǔn)確分析以上多種核型。ENA是可提取性核抗原的總稱，是細(xì)胞核和細(xì)胞漿中抗小分子核糖核蛋白的自身抗體，分子中不含DNA，該組成使其各自的抗原性得以增強(qiáng)?？笵NA抗體中抗dsDNA抗體。又稱抗脫氧核糖核酸抗體。

98例ANA陽性血清標(biāo)本中，常見核型有細(xì)胞核顆粒型41/98(41.84%)、細(xì)胞核均質(zhì)型36/98(36.74%)和細(xì)胞核仁型11/98(11.22%)。98例ANA與抗ENA抗體同時(shí)陽性血清標(biāo)本中，抗ds-DNA陽性率為42例42.86%。在42例抗ds-DNA陽性血清中，細(xì)胞核均質(zhì)型21/42(50%)，細(xì)胞核顆粒型20/42(47.62%)，細(xì)胞核模型1/42(2.38%)?？筪s-DNA抗體，主要和核型是均質(zhì)性和核顆粒型，少有細(xì)胞核模型。

98例ANA陽性血清標(biāo)本中，54例抗SS-A抗體陽性，細(xì)胞核均質(zhì)型24(24.49%)，細(xì)胞核顆粒型15(15.31%)，細(xì)胞核仁型10(10.21%)，54例抗SS-A抗體陽性中抗ds-DNA抗體陽性27例，SS-A抗體陽性可一種或一種以上多核型重疊出現(xiàn)，與抗ds-DNA等多種抗體存在相關(guān).國內(nèi)外報(bào)道，AID中是一種以免疫調(diào)節(jié)異常為特征的自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，個(gè)體血清中可出現(xiàn)一種或多種自身抗體ANA核型[3]?？筪s-DNA抗體是SLE特異標(biāo)志抗體陽性率(40%～90%)均質(zhì)型的高滴度的ANA標(biāo)本可高頻率檢出抗ds-DNA抗體 ，抗ds-DNA抗體含量與ANA熒光強(qiáng)度成正比[4]?？笶N抗體中Sm抗體也是SLE的標(biāo)記抗體，ANA核型主要細(xì)胞核顆粒型熒光核型(19例，19.39%)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ANA包被基質(zhì)熒光染色膜型與抗ENA抗體及抗ds-DNA抗體之間有相對(duì)應(yīng)性，不同的特異抗體也可以顯現(xiàn)類同的熒光染色模型，而同一特異抗體可以在不同血清標(biāo)本中顯現(xiàn)不同熒光染色模型。ANA熒光染色模型與特異性抗體有一定的相對(duì)應(yīng)性，但沒有絕對(duì)的規(guī)律可循，但熒光核型可全面評(píng)估參考，對(duì)進(jìn)一步特異性自身抗體檢測(cè)提供重要參考[5]。ANA核型熒光核型尤其對(duì)發(fā)現(xiàn)罕見特異抗體提供信息，本組病例收集檢測(cè)得到的抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體在就診人群中的陽性率低與樣本收集局限有關(guān)。

ANA檢測(cè)及核型分析，可針對(duì)性地選擇相關(guān)的特異抗體測(cè)定，避免了盲目地重復(fù)檢測(cè)。無癥狀人群中也有自身抗體陽性，這可能正如Nielen和Arbuckle等認(rèn)為的自身抗體陽性的出現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于（甚至提前10年）臨床癥狀的出現(xiàn)和發(fā)病[6,7]。協(xié)同ANA、抗ENA抗體和抗ds-DNA抗體的檢測(cè)不僅對(duì)AID的診斷具有較高敏感性和特異性，并與臨床表現(xiàn)結(jié)合診斷，及早治療及預(yù)后提供有效信息。

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Association among ANA Patterns, Anti-ENA Antibody and Anti-dsDNA Antibody in Autoimmune Disease

SUN Shan-hui, ZHENG Yan, ZHANG Mao-xiu
(Medical Research and Laboratory Diagnostic Center, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China)

Objective To investigate the association among ANA patterns, anti-ENA antibody and anti-dsDNA antibodies in autoimmune diseases, and the reference significance of detecting these antibodies on the diagnosis and differential diagnosis of autoimmune diseases. Methods Serum samples from 98 pateints with autoimmune disorder were collected. ANA, anti-ENA and anti-dsDNA antibodies were detected using IIF, immuno-dot assay and ELISA. Results The distribution of different ANA nuclear types in the 98 samples was: pattern homogeneous (36.74%); pattern nucleoplasm granular (41.84%); pattern nucleolar (11.22%); pattern nuclear membrane (1.02%); pattern centromere (1.02%); pattern homogeneous/nucleoplasm granular (2.04%)and pattern homogeneous/cytoplasm granular (6.12%). These patterns may occur separately, also could appear at the same sample. Among these 98 samples with both ANA and anti-ENA positive, 42 cases were anti-dsDNA antibodies positive (42.86%). In the 36 patients with ANA-homogeneous, 24 cases were anti-SSA /Ro antibody positive, 6 cases were anti-SSB/La antibody positive, and 6 cases were nRNP/Sm antibody positive. While in the 41 ANA-nucleoplasm granular samples, the positive rates of SSARo, SSB/La and nRNP/Sm antibodies were 15.31%, 6.12% and 19.39%. One or several kinds of ENA antibodies could appear in patients with positive ANA and anti-dsDNA antibodies. Conclusion The familiar nuclear types of ANA include pattern nucleoplasm granular, pattern homogeneous and pattern nucleolar. They occur individually or concurrently, which was correlated with the appearance of anti-ENA and antidsDNA antibodies. Combined detection of ANA, ENA and dsDNA antibodies has higher specificity, sensibility and accuracy in the diagnosis of autoimmune diseases, and is better in describing the correlation of the auto-antibodies appeared in patients and his clinical manifestation, thus provide valuable reference index to the diagnosis, differential diagnosis and therapy of AID.

Antinuclear antibody; Anti-ENA antibodies; Anti-double stranded DNA antibodies; Indirect immunofluorescence; Nucleus type

R446；R593.2

B

1671-8194（2013）36-0020-03

*通訊作者：E-mail:cnfu@sina.com