正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化龍眼葉提取工藝

梁 潔 柳賢福 孫正伊 呂松林 翁 翎

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

龍眼葉藥材為無(wú)患子科龍眼屬龍眼Dimocarpus longan Lour．的葉或嫩芽，具有發(fā)表清熱，利濕解毒之功效，主治感冒發(fā)熱，瘧疾，疔瘡，濕疹［1］。龍眼葉主要含有鞣質(zhì)、酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)及揮發(fā)油等成分［2－4］，其中黃酮類(lèi)化合物是龍眼葉的主要化學(xué)成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交設(shè)計(jì)對(duì)龍眼葉超聲提取工藝進(jìn)行了研究，以槲皮素的含量為考察指標(biāo)，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，考察了甲醇濃度、溶劑用量和提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，優(yōu)選出最佳提取工藝，為龍眼葉的提取工藝研究提供試驗(yàn)參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司);LG 16－W型高速離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng));B3500S－MT超聲清洗儀 (上海必能信超聲有限公司);Millipore Simplicity－185超純水儀 (美國(guó)密里博公司);BP211D電子分析天平 (德國(guó)賽多利斯)。

槲皮素對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100081－200406，供含量測(cè)定用);甲醇 (色譜純，美國(guó)Fisher科學(xué)世界公司);水為超純水。龍眼葉采自廣西賀州市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室滕建北副教授鑒定為Dimocarpus longan Lour．的葉;實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 槲皮素含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil C18柱 (4.6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇－0.2%磷酸 (47∶53);檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm;流速:1.0ml·min－1。柱溫:30℃;進(jìn)樣量為10 μl。槲皮素理論板數(shù)≥5000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定經(jīng)五氧化二磷減壓干燥36h槲皮素對(duì)照品9.00mg置25ml量瓶中，加甲醇適量使溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.36mg·ml－1的槲皮素對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取龍眼葉藥材粉末約1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－鹽酸 (4∶1)混合溶液20ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲提取50min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇－鹽酸 (4∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 龍眼葉提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 選擇甲醇體積濃度 (A)、甲醇用量 (B)、提取時(shí)間 (C)3因素為考察因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，以L(fǎng)9(34)正交設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，以龍眼葉中槲皮素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析表

2.2.2 結(jié)果 因素極差R越大，說(shuō)明因素的水平改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響也越大。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀(guān)分析及方差分析可知，影響槲皮素提取效果的因素大小順序?yàn)锳＞B＞C，即甲醇濃度＞甲醇用量＞提取時(shí)間，其中甲醇濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取方法為A3B1C3，即用20ml的100%甲醇－鹽酸 (4∶1)超聲處理50min。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，取3份龍眼葉藥材粉末1g按上述最佳工藝條件A3B1C3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，按“2.1.1”項(xiàng)下所述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明槲皮素含量為 3.6545mg·g－1，RSD=0.72%，與正交試驗(yàn)最佳方案一致，說(shuō)明優(yōu)化是成功的。

3 討論

超聲提取主要是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震動(dòng)和空化效應(yīng)加速植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散并溶入溶劑中，同時(shí)可保持被提取物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性不發(fā)生變化［5］。目前，超聲提取法已廣泛應(yīng)用于多糖、苷類(lèi)、生物堿、黃酮類(lèi)等化合物的提取，并已顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)以槲皮素的含量為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了龍眼葉超聲提取的最佳提取工藝，為龍眼葉的純化工藝奠定基礎(chǔ)。

［1］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)．中華本草 (13卷)［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:112．

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院．中藥大辭典 (第2版)(上冊(cè))［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:879．

［3］梁潔，滕建北，柳賢福，等．龍眼葉化學(xué)成分預(yù)試研究［J］．中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010，19(4):142－143．

［4］梁潔，王雯慧，甄漢深，等．廣西產(chǎn)龍眼葉及花揮發(fā)油成分氣質(zhì)聯(lián)用分析［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010:16(9):52－55．

［5］邱天堯，王秀芬，姚中華．超聲技術(shù)在中草藥成分提取中的應(yīng)用．黑龍江醫(yī)藥，2007，20(5):455－456．