類芽胞桿菌堿性果膠裂解酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)表征

熊 斌，應(yīng)向賢，陳麗娜，謝麗萍，魏 春，汪 釗

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州310014）

類芽胞桿菌堿性果膠裂解酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)表征

熊 斌，應(yīng)向賢，陳麗娜，謝麗萍，魏 春，汪 釗

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州310014）

從類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008的發(fā)酵上清液中純化得到一個高活力堿性果膠裂解酶，經(jīng)SDS?PAGE電泳估算其亞基相對分子質(zhì)量為4.5×104。通過對該酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)：該酶能催化裂解果膠酸、低酯果膠和高酯果膠；酶催化反應(yīng)最適溫度范圍為55～60℃，最適pH為9.6，在最適條件下以低酯果膠為底物酶的比酶活達(dá)3 021.6 U／mg；Ca2＋能增強(qiáng)該酶的活力，而Mn2＋，Ba2＋和EDTA強(qiáng)烈抑制該酶活力；當(dāng)沒有Ca2＋存在時，高度酯化的果膠是該酶的最適底物，在4mmol／LCa2＋存在時，該酶以果膠酸為底物比酶活最高（25 467 U／mg）。該酶N端序列比對分析發(fā)現(xiàn)與類芽胞桿菌Paenibacillus amylolyticus strain 27c64果膠裂解酶高度同源。

酶學(xué)性質(zhì)；酯化果膠；堿性果膠酶；純化

果膠裂解酶（PEL，EC 4.2.2.2）能通過β-消除斷裂聚半乳糖醛酸（PGA）的α-1，4糖苷鍵得到4，5位不飽和產(chǎn)物［1］。堿性果膠酶通常在pH 8～10的環(huán)境中催化效率較高，是對棉織物精煉效果最好的酶［2］，可以從未加工棉中去除非纖維素物質(zhì)從而提高棉的吸收能力和潔白度［3］。與化學(xué)加工過程相比，紡織原料的酶法生物精煉對環(huán)境更友好。除此之外，堿性果膠酶還可用于麻類生物脫膠、生物制漿、果膠低聚糖制備等方面，同時它也是一種重要的飼料用酶［4］。最新的研究表明堿性果膠酶在植物抗病中具有良好的誘導(dǎo)效果［56］。

堿性果膠酶的嗜堿性是其基本特征，細(xì)菌堿性果膠裂解酶最適作用pH一般在8～10，有報道果膠裂解酶最適pH可高達(dá)11.5［7］。由于許多細(xì)菌在偏堿性的環(huán)境生長良好，因而細(xì)菌是堿性果膠裂解酶的主要微生物來源。許多微生物堿性果膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)已被表征，其微生物來源包括Bacillus、Paenibacillus、Pseudomonas、Erwinia和Xanthomonas等［4］。盡管堿性果膠酶的相關(guān)研究已有較多報道，但發(fā)現(xiàn)并研究新型高活力的堿性果膠裂解酶對其工業(yè)應(yīng)用仍具有重要的意義。

堿性果膠裂解酶產(chǎn)生菌Paenibacillus sp. WZ008是從腐爛的水果表皮篩選到的，筆者所在課題組吳茜等［8］前期研究已表明其在生物精煉上具有應(yīng)用潛力。在此基礎(chǔ)上，筆者對類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008堿性果膠裂解酶進(jìn)行分離純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)表征，以期為其工業(yè)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008是浙江工業(yè)大學(xué)生物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室篩選并保存的菌種。

1.1.2 試劑與藥品

層析填料Ceramic Hydroxyapatite TYPEⅠ，Bio?Rad公司；層析填料SuperdexTM200 prep grad，GE Healthcare公司；果膠酸、低酯及高酯果膠均由衢州果膠公司提供。其他試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

蛋白質(zhì)電泳儀、低壓層析儀（BioLogic LP，Bio?Rad公司），AKTA蛋白層析系統(tǒng)、紫外可見分光光度計（Amersham公司）。

1.2 方法

1.2.1 類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008的培養(yǎng)

用于類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008生長的液體培養(yǎng)基組成：1 L的培養(yǎng)基中蛋白胨10 g；酵母膏10 g；酯化果膠6 g。固體培養(yǎng)基在上述液體培養(yǎng)基中加入20 g／L的瓊脂。類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008在該液體培養(yǎng)基中于30℃、200 r／min下培養(yǎng)46 h。所得的發(fā)酵液于6 000 g下離心15 min，收集上清液用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的純化

將離心得到的500 mL上清液先用50%的飽和（NH4）2SO4沉淀去除雜質(zhì)，然后用80%的飽和（NH4）2SO4沉淀果膠酶。將用80%的飽和（NH4）2SO4得到的沉淀重新懸浮于含有5 mmol／L K3PO4的50 mmol／L Tris?HCl緩沖液（pH 8.0）中。懸浮好的酶液以0.5 mL／min的流速上樣到預(yù)先平衡好的羥基磷灰石柱中（1.5 cm×20 cm），上樣量為10 mL，用含有5～250 mmol／L K3PO4的Tris?HCl（50 mmol／L，pH 8.0）線性梯度洗脫果膠酶，洗脫流速為1 mL／min。將含有果膠酶活力的洗脫組分合并到一起，并通過PM-30的超濾膜濃縮。濃縮好的試樣（0.5 mL）用于后續(xù)Superdex 200凝膠過濾色譜（1.0 cm×30 cm），該柱的平衡和洗脫都以50 mmol／L Tris?HCl（pH 8.0）為緩沖液，流速為0.5 mL／min。在分離過程中，果膠裂解酶試樣通過SDS?PAGE電泳來驗(yàn)證其純度。純化后的果膠裂解酶N-端序列測定由上?；瞪锛夹g(shù)公司完成。

1.2.3 果膠裂解酶活力測定

果膠裂解酶活力的測定是通過測定其在235 nm處的吸光度增值來實(shí)現(xiàn)的［9］。反應(yīng)的具體流程如下：先將400μL的底物溶液（50 mmol／L pH 9.6的Gly?NaOH緩沖液中含有0.33%的聚半乳糖醛酸或果膠）于55℃下預(yù)熱，然后加入200μL的酶液，于55℃下保溫10 min。取出200μL的反應(yīng)液加入1.8 mL HCl（0.01 mol／L）終止反應(yīng)，最后測定波長235 nm的吸光值。一個酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量，計算所使用的摩爾消光系數(shù)為4 600 cm2／mol［10］。文中所有相對活力的100%均指以20%酯化果膠為底物測得的比酶活。

1.2.4 果膠裂解酶的性質(zhì)表征

用于果膠裂解酶最適pH測定的緩沖液為50 mmol／L Tris?HCl（pH 7.9～8.8）和Gly?NaOH（pH 8.8～11.1）。酶的pH穩(wěn)定性測定是將酶置于pH 9.3或9.6的緩沖液中于4℃下保留一段時間，然后測定殘留活力。溫度對酶活力影響是在pH 9.6的Gly?NaOH中進(jìn)行，溫度變化范圍40～70℃。0.33 mmol／L不同金屬離子加入到反應(yīng)體系中，然后檢測活力，從而確定不同金屬離子對酶的影響。為了測定酶的熱穩(wěn)定性，先將酶液分別于50、55和60℃孵育，然后按照常規(guī)的活力測定方法測定其殘留活力。酶動力學(xué)參數(shù)測定反應(yīng)體系如下，底物質(zhì)量濃度范圍為0.2～8 mg／mL，溫度為55℃，緩沖液為pH 9.6的50 mmol／L Gly?NaOH，利用雙倒數(shù)作圖法計算Vmax和Km值。

1.2.5 蛋白質(zhì)濃度和果膠裂解酶亞基相對分子質(zhì)量的測定

蛋白質(zhì)濃度的測定采用Bradford檢測法［11］，果膠酶亞基相對分子質(zhì)量通過SDS?PAGE電泳測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的分離純化

通過（NH4）2SO4沉淀、羥基磷灰石和凝膠過濾色譜等步驟對類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008果膠酶進(jìn)行分離純化，結(jié)果見表1。由表1可知：總純化倍數(shù)為53.5倍，酶活力總收率為27%，純酶的比酶活達(dá)到3 021.6 U／mg，高于已報道的果膠裂解酶活力［1，12-13］，屬于高活力果膠裂解酶。SDS?PAGE電泳鑒定結(jié)果見圖1。由圖1可知，純化后的酶只有單一條帶，估算其亞基相對分子質(zhì)量為4.5×104。

表1 類芽胞桿菌Paenibacillus sp.W Z008果膠裂解酶的分離純化Table 1 Purification of pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

圖1 Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的SDS?PAGE分析結(jié)果Fig.1 SDS?PAGE analysis of purified pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

2.2 類芽胞桿菌Paenibacillus sp.WZ008果膠裂

解酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 pH對酶活力影響

考察pH對Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的催化活力的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知：在pH 7.8～11.1范圍內(nèi)該酶都有活力，當(dāng)pH為9.6時酶活力最高，因此該果膠酶屬于堿性果膠酶家族。對其pH穩(wěn)定性的分析表明，當(dāng)酶在4℃下于pH 9.3和9.6緩沖液中孵育4 h后，酶的殘留活力分別為初始活力的96.5%和74.7%，表明該酶在堿性條件下具有良好的穩(wěn)定性。

圖2 pH對Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的催化活力影響Fig.2 Effects of pH on activity of purified pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

2.2.2 溫度對酶活力影響

由于細(xì)菌堿性果膠裂解酶的最適作用溫度一般為40～70℃［14］，所以筆者考察不同溫度（40～70℃）下，溫度對Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶活力的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：酶的最適溫度范圍為55～60℃。純酶在低于50℃的條件下活力相對比較穩(wěn)定，同時，該酶在50℃下活力半衰期為15 h。當(dāng)溫度增加到55℃時，酶的半衰期降至3 h，而溫度高于60℃時，酶則會很快失活（圖4）。

圖3 溫度對Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶活力的影響Fig.3 Effects of tem perature on activity of pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

圖4 Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermostability of pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

2.2.3 金屬離子和EDTA對酶活力影響

考察不同金屬離子對酶活力影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知：0.33 mmol／L的Ca2＋極大增強(qiáng)了酶的活力，與不加Ca2＋對照相比，活力提高了1.7倍，同時，其他二價金屬離子，如Mg2＋、Cu2＋、Co2＋、Ni2＋和Zn2＋對酶活力影響不明顯，酶活力范圍為不加Ca2＋對照的95%～109%（圖5）。Ba2＋能強(qiáng)烈地抑制該果膠裂解酶的活力，其酶活力僅為不加Ca2＋對照的7%，這一性質(zhì)與報道的來自芽胞桿菌Bacillus sp. BP-23果膠裂解酶相似［15］。另外，Mn2＋和EDTA也對酶有明顯的抑制作用，其酶活力分別為不加Ca2＋對照的66%和53%。在沒有外加Ca2＋的情況下該酶仍有較高活力，這可能是由于底物中微量的殘留Ca2＋引起的。當(dāng)PGA、20%酯化果膠和70%酯化果膠分別用作底物時，最適Ca2＋添加濃度分別為2、4和4 mmol／L（圖6）。

圖5 金屬離子和EDTA對酶活力的影響Fig.5 Effects ofmetal ions on activity of pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

圖6 Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的底物特異性Fig.6 Substrate specificity of purified pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

2.2.4 底物特異性

分別考察該果膠裂解酶對PGA、20%酯化果膠和70%酯化果膠的特異性，催化反應(yīng)中Ca2＋添加量范圍是0～10 mg／mL。當(dāng)不向反應(yīng)中外加Ca2＋時，該果膠酶對70%酯化果膠活力最高（25 467 U／mg），分別是PGA和20%酯化果膠活力的3.09和1.88倍。當(dāng)反應(yīng)混合體系中加入4 mmol／L CaCl2時，酶對PGA活力最高，分別是20%和70%酯化果膠活力的1.25和1.46倍（圖6）。

2.2.5 動力學(xué)參數(shù)

分別以PGA，20%酯化果膠和70%酯化果膠為底物，在0.2～8 mg／mL底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)測定酶的比酶活，結(jié)果見圖7。由圖7可知：在不同底物下，該果膠裂解酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)均符合Michaelis?Menten動力學(xué)，因而經(jīng)Lineweaver?Burk雙倒數(shù)作圖法計算酶動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值。當(dāng)所用底物為20%酯化果膠時，酶的Km值為3.77 mg／mL，酶促反應(yīng)的Vmax為8 560 U／mg，而底物變?yōu)?0%酯化果膠時，酶的Km值增加到4.17 mg／mL，酶促反應(yīng)Vmax則變?yōu)?0 800 U／mg。該果膠裂解酶對PGA的Km值為3.39 mg／mL，同時酶促反應(yīng)Vmax為9 400 U／mg。

圖7 酶在不同底物濃度下的比酶活Fig.7 Effects of substrate concentrations on activity of pectate lyase from Paenibacillus sp.WZ008

2.2.6 N-端序列結(jié)果

經(jīng)測定得到該果膠裂解酶的N-端序列為AGNADYNLTGFSQGN，通過Blast序列比對發(fā)現(xiàn)，該序列與來自類芽胞桿菌Paenibacillus amylolyticus strain 27c64果膠裂解酶PelB的同源序列具有很高的相似度（14／15的相似度）。與Paenibacillus sp. WZ008果膠裂解酶類似，該類芽胞桿菌果膠裂解酶也表現(xiàn)出對酯化果膠和聚半乳糖醛酸均有活力［15］，但其活力卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本文所報道的果膠裂解酶。另外，作為胞外酶，Paenibacillus sp.WZ008果膠裂解酶的N-端序列以丙氨酸而不是以甲硫氨酸為起始氨基酸，這也意味著該酶的信號肽在翻譯后已被切除。

3 結(jié) 論

通過（NH4）2SO4沉淀、羥基磷灰石柱層析及凝膠過濾柱層析從類芽胞桿菌發(fā)酵液中純化得到一個果膠裂解酶。該酶底物譜廣，以果膠酸、低酯果膠或高酯果膠為裂解底物時該酶均表現(xiàn)出高活力。該酶最適作用pH為9.6，屬于堿性果膠裂解酶，在堿性條件下具有良好的穩(wěn)定性。最適作用溫度范圍為55～60℃，在50℃下熱穩(wěn)定性較好。Ca2＋對酶的活力具有顯著促進(jìn)作用。該酶N-端序列比對分析表明與一個解淀粉類芽胞桿菌果膠酶高度同源，而其活力遠(yuǎn)高于解淀粉類芽胞桿菌果膠酶，以高酯果膠為底物時酶動力參數(shù)Vmax可高達(dá)10 800 U／mg。

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Purification and characterization of alkaline pectate lyase from Paenibacillus sp．WZ008

XIONG Bin，YING Xiangxian，CHEN Lina，XIE Liping，WEIChun，WANG Zhao

（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

An extracellular pectate lyase was purified from the culture supernatant of Paenibacillus sp. WZ008 grown in the pectin?containingmedium.The subunitmolecular weight of the purified enzyme was determined to be around 4.5×104by SDS?PAGE analysis.It showed activity on both polygalacturonic acid and methylated pectins.The optimum activity of the purified enzyme was demonstrated in a temperature range of 55℃to 60℃and at pH 9.6.The specific activity of pectate lyase was up to 3 021.6 U／mg using 20%methylated pectin as substrate under the optimized conditions.The Ca2＋enhanced the enzyme activity but Mn2＋，Ba2＋，and EDTA strongly inhibited it.Highlymethylated pectin was the optimum substratewithout Ca2＋addition while the enzyme exhibited themaximal activity（25 467 U／mg）on polygalacturonic acid in the presence of 4 mmol／L Ca2＋.The amino?terminal sequence of the enzyme was highly identical to that of a pectate lyase from Paenibacillus amylolyticus strain 27c64.

characterization；methylated pectin；alkaline pectate lyase；purification

Q814

A

1672-3678（2013）06-0042-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.009

2013-01-30

浙江省自然科學(xué)基金（LY12B06010）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金（第40批）

熊 斌（1988—），男，湖北荊州人，碩士研究生，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化；汪 釗（聯(lián)系人），教授，E?mail：hzwangzhao＠163.com