人源雙歧桿菌的分離純化及鑒定

熊 強，楊青麗，韓 浩

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211800）

人源雙歧桿菌的分離純化及鑒定

熊 強，楊青麗，韓 浩

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211800）

利用改良的乳酸細菌（MRS）培養(yǎng)基從健康人群的糞便中進行雙歧桿菌的分離篩選。結果表明：在添加有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培養(yǎng)基上雙歧桿菌的菌落呈典型的乳白色并帶有藍色，其他菌株的菌落呈白色或深藍色。實驗共分離出10株疑似菌株，經生理生化試驗和Biolog自動微生物分析系統(tǒng)鑒定，結果發(fā)現(xiàn)其中4株為雙歧桿菌，這4株菌中有3株為兩歧雙歧桿菌，1株為長雙歧桿菌。和傳統(tǒng)MBS培養(yǎng)基相比較，改良MRS培養(yǎng)基能顯著提高篩選效率。

雙歧桿菌；鑒定；分離；MRS培養(yǎng)基

雙歧桿菌是1899年巴斯德研究院的Tissier博士首先在以母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離出來的［1］，它是常見的人體腸道菌群中的重要成員［2］，具有維護腸道生態(tài)平衡、抗菌、增強免疫功能和抗腫瘤等多種生物學功能［3-4］。近年來，隨著人民健康意識的不斷提升，雙歧桿菌在保健食品的應用也越來越廣泛。但是由于雙歧桿菌是嚴格厭氧菌，對營養(yǎng)條件要求特別苛刻［5］，在和其他腸道細菌共存的條件下分離比較困難。

筆者通過在乳酸細菌（MRS）培養(yǎng)基中添加不同的物質，選擇性抑制一些腸道細菌，并根據(jù)雙歧桿菌的菌落形態(tài)和色澤達到雙歧桿菌快遞分離和篩選的目的，以期為以后的科研和生產構建良好的種質資源基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試樣來源

新鮮糞便：采自南京工業(yè)大學的健康學生。

1.1.2 培養(yǎng)基

緩沖蛋白胨水溶液［6］（1 L）：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，Na2HPO42 g，KH2PO42 g。

MRS固體培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨5 g，酵母浸出粉5 g，檸檬酸鐵銨2 g，乙酸鈉5 g，Na2HPO42 g，MnS04·H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，葡萄糖15 g，乳糖5 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，吐溫-80 1 mL，瓊脂25 g。調pH 6.7，121℃滅菌15 min。

改良MRS固體培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基的基礎上分別添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）0.06 g／L，LiCl 4 g／L。

1.1.3 儀器設備

YOX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），SW-CJ-1FD型超凈臺（蘇州安泰空氣技術公司），YXQ-LS-50S11型滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），Biolog全自動微生物鑒定儀（美國Biolog公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 試樣的采集與處理

用滅菌竹簽迅速挑取新鮮的人體糞便少許，放入已滅菌好的裝有9 mL的緩沖蛋白胨水溶液的試管中，充分振蕩搖勻，制備菌懸液，然后用無菌緩沖蛋白胨水溶液進行梯度稀釋至10-7。

1.2.2 雙歧桿菌的分離和篩選

取適宜的連續(xù)3個梯度的稀釋液各1 mL分別注入無菌平皿中，傾注法制備平板，每個稀釋度2塊平皿，待冷卻后立即放入厭氧培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)48～72 h。根據(jù)菌落形態(tài)結合革蘭氏染色結果，對雙歧桿菌疑似菌株進行進一步的劃線分離，重復劃線轉接，直至獲得鏡檢純的菌株為止。

1.2.3 雙歧桿菌的鑒定

首先對篩選出的雙歧桿菌疑似菌株進行需氧性鑒定，然后對需氧性鑒定陰性菌株進行接觸酶試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、V.P.試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、脲酶試驗，淀粉水解試驗［7］。在上述試驗的基礎上，利用Biolog自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定［8］。

2 結果與討論

2.1 菌落及菌落形態(tài)的觀察

對篩選得到的菌株在MRS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)不同菌株的菌落形狀不同、大小不一，有白色和淡黃色2種，挑取圓形表面光滑的白色菌落進行染色，鏡檢后可以看到菌株有革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，呈球形、桿狀、細長狀等多種形態(tài)，經反復劃線后仍然難以得到純培養(yǎng)物，鏡檢觀察仍有革蘭氏陰性菌存在，雙歧桿菌的分離比較困難。

在改良MRS培養(yǎng)基上可以看到平板上菌落形態(tài)各異。菌落色澤主要有白色、藍色底蘊乳白色菌落、藍色菌落3種，形態(tài)為凸狀、圓形且表面光滑。分別挑取3種不同顏色的菌落進一步劃線分離。結果發(fā)現(xiàn)：有藍色底蘊乳白色菌落的菌體特征比較符合雙歧桿菌的形態(tài)特征，這與長雙歧桿菌在該培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色（圖1）基本一致，且有比較明顯的V型、Y型和棒狀（圖2），以革蘭氏陽性菌居多；但是白色菌落和藍色菌落的菌體以直桿狀、球形的為主，且革蘭氏陰性菌較多，不符合雙歧桿菌的特性。這說明在MRS培養(yǎng)基上添加X-Gal可以提高雙歧桿菌的篩選效率。最終，從25份健康學生的糞便中共獲得10株雙歧桿菌的疑似株（編號分別為B3、B4、B6、B8、B13、B17、B19、B20、B23和B24）。

圖1 長雙歧桿菌在改良的MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of B．longum on improved MRSmedium

圖2 雙歧桿菌疑似菌株的菌體形態(tài)（×1 000）Fig.2 Cellmorphology of candidate Bifidobacterium（×1 000）

本試驗的目的是從健康人的腸道中獲得雙歧桿菌，由于健康人的腸道中有大量的微生物，因此從成人糞便中分離雙歧桿菌相對比較困難。常規(guī)方法所使用的MRS培養(yǎng)基對目的微生物的鑒別能力不強，造成篩選的效率不高。筆者在MRS培養(yǎng)基中添加LiCl（4 g／L）和X-Gal（0.06 g／L），能有效提高培養(yǎng)基對雙歧桿菌的鑒別能力。一方面，添加的LiCl可以抑制大腸桿菌和乳酸菌的生長［9］，選擇性抑制雜菌的干擾；另一方面可以根據(jù)菌落的顏色方便快捷地篩選到目的微生物。多數(shù)雙歧桿菌和乳酸菌在生長中均能產生半乳糖苷酶，使底物X-Gal分解，釋放出吲哚從而使菌落顯色，不同菌種由于半乳糖苷酶的活力不同而使菌落呈現(xiàn)不同的色澤［10］，依此可作為鑒別依據(jù)。雙歧桿菌的菌落呈乳白色帶有藍色，這與江曉等［11］所報道的文獻結果一致，而與孫雪等［12］和刁治民等［13］所報道的文獻不一致，這可能是因為所選的培養(yǎng)基不一樣。孫雪等［12］在NPNL培養(yǎng)基上雙歧桿菌的菌落亦呈深藍色；刁治民等［13］在改良的MRS培養(yǎng)基中添加X-Gal，雙歧桿菌菌落呈深藍色，從而呈現(xiàn)不同的結果。造成上述顏色反應不一致的原因也可能和分離的手段有關，如涂布接種和傾注接種對菌落的色澤有一定的影響。

2.2 生理生化試驗結果

10株雙歧桿菌疑似菌株進行生理生化試驗鑒定，結果發(fā)現(xiàn)B8和B19在厭氧和有氧條件下均能生長，因此淘汰這2株菌，對剩余8株菌的進一步進行生理生化試驗，結果見表1。

表1 菌株的生理生化試驗結果Table 1 Results of physiological and biochem ical tests on the candidate Bifidobacterium

由表1可知：B3，B6這2株菌株不是雙歧桿菌，其余的均可以初步斷定是雙歧桿菌。

2.3 Biolog自動微生物分析系統(tǒng)的鑒定結果

對初步確定為雙歧桿菌的菌株利用Biolog自動微生物分析系統(tǒng)進行進一步鑒定。在Microlog應用程序中選擇的培養(yǎng)時間20～24 h，鑒定板類型AN，菌株類型AN?GP。鑒定結果見表2。

表2 利用Biolog自動微生物分析系統(tǒng)進行菌株鑒定的結果Table 2 Results of the Biolog automated m icrobial analysis system on candidate Bifidobacterium

由表2可知：菌株B4，B17和B23為兩歧雙歧桿菌（圖3），B20為長雙歧桿菌（圖4），而B13未鑒定出，說明該菌株不是雙歧桿菌，而B24的相似度低于0.5，可靠性很低，無法判斷其是否是雙歧桿菌，可利用16S rDNA等分子生物學手段進一步鑒定。

圖3 兩歧雙歧桿菌的菌體形態(tài)（×1 000）Fig.3 Cellmorphology of B．bifidum（×1 000）

由于雙歧桿菌菌體形態(tài)的不穩(wěn)定，同一菌株在生長的不同時期或不同條件下也可能顯現(xiàn)不同的形態(tài)［14］，而且經過多次傳代培養(yǎng)后革蘭氏染色將會從陽性轉變?yōu)殛幮裕?3］，因此菌株在初次分離時菌體有比較明顯的V型、Y型和棒狀，多次傳代后菌體的形態(tài)變?yōu)檩^小的、彎曲的桿狀，有些菌株的革蘭氏染色結果甚至顯示為陰性。此外，由于雙歧桿菌在實驗室傳代的過程中不能保證嚴格的厭氧條件，野生菌株在人工培養(yǎng)條件下可能發(fā)生一定的變異，因此在利用Biolog全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定雙歧桿菌前應嚴格控制傳代次數(shù)，且應注意接種好的鑒定板在培養(yǎng)時厭氧環(huán)境中不能含H2，否則會影響實驗結果的準確性。

圖4 長雙歧桿菌的菌體形態(tài)（×1 000）Fig.4 Cellm orphology of B．longum（×1 000）

3 結 論

利用改良的MRS培養(yǎng)基從健康人的腸道中篩選得到10株雙歧桿菌疑似菌株，經生理生化和Biolog自動微生物分析系統(tǒng)鑒定，3株為兩歧雙歧桿菌，1株為長雙歧桿菌。和傳統(tǒng)MRS培養(yǎng)基相比較，改良MRS培養(yǎng)基能顯著提高篩選的效率。

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The identification of Bifidobacterium form human feces

XIONG Qiang，YANG Qingli，HAN Hao

（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211800，China）

A Bifidobacterium strain was separated and raised from the excrement of the healthy adults，using the improved MRSmedium.The result showed that the colors were different on the MRSmedium with X?Gal，and the Bifidobacterium colonies were milky white with blue background，while other strain colonieswerewhite and dark blue.According to the results of physiological tests and the Biolog automated microbial analysis system，4 strains of Bifidobacterium from 10 were identified，3 strains were B．bifidum and the other was B．longum.Meanwhile，the research results showed that，compared with the MBS medium，the improved MRSmedium could significantly enhance the separation efficiency.

Bifidobacterium；identification；isolation；MRSmedium

S852.6

A

1672-3678（2013）06-0038-04

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.008

2013-01-05

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CB200906）

熊 強（1970—），男，江蘇南京人，副教授，研究方向：微生物與發(fā)酵工程，E?mail：xiongqiang＠njut.edu.cn