硫胺素對(duì)Arthrobacter sp.A302環(huán)磷酸腺苷發(fā)酵的影響

要世偉，牛歡青，陳 勇，應(yīng)漢杰

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

硫胺素對(duì)Arthrobacter sp.A302環(huán)磷酸腺苷發(fā)酵的影響

要世偉，牛歡青，陳 勇，應(yīng)漢杰

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

研究在培養(yǎng)基中加入硫胺素（VB1）對(duì)cAMP發(fā)酵的影響。結(jié)果表明：VB1的最適添加量為0.5 g／L，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酸腺苷（cAMP）產(chǎn)量和細(xì)胞干質(zhì)量分別提高了36.4%和41.8%，達(dá)到7.5和7.8 g／L。琥珀酸和α-酮戊二酸的含量有明顯的提高，平均提高了43.59%和40.77%；同時(shí)，主要副產(chǎn)物乙酸的含量沒有明顯變化。在發(fā)酵過程中，VB1的加入對(duì)ATP的含量及與cAMP合成密切相關(guān)的幾種酶的活性也有顯著的影響。

硫胺素（VB1）；cAMP；Arthrobacter

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）作為細(xì)胞的第二信使，在生物的代謝過程、基因表達(dá)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞遷移等許多生物過程中起到非常重要的作用［1-2］。cAMP具有多種藥理學(xué)功能，例如增強(qiáng)肝臟功能，舒張血管，放寬平滑肌和促進(jìn)神經(jīng)再生［3］。微生物法生產(chǎn)cAMP比化學(xué)合成法更簡(jiǎn)單，成本更加低廉，因此具有廣闊的發(fā)展前景［4］。

目前，利用生物法合成cAMP仍有許多問題，其根本問題是產(chǎn)量不高。在Arthrobacter sp.A302中，對(duì)cAMP合成途徑（圖1）的研究發(fā)現(xiàn)，cAMP是由AMP轉(zhuǎn)化為ATP，然后再環(huán)化得到的［5］。在由AMP合成ATP的過程中需要大量的能量供給，而己糖磷酸途徑（EMP）和三羧酸循環(huán)途徑（TCA）是生物體能量的主要來源。因此，EMP途徑和TCA循環(huán)途徑在該過程中具有重要作用，加強(qiáng)EMP途徑和TCA循環(huán)對(duì)提高cAMP的產(chǎn)量具有很重要的意義。另外，AMP是由IMP合成得到，而IMP的合成底物為PRPP。在Arthrobacter sp.A302中，通過補(bǔ)救途徑來合成cAMP是一條非常重要的代謝途徑［5］。因此，PRPP在cAMP的合成過程中是一個(gè)關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，提高PRPP在代謝過程中的積累是提高cAMP產(chǎn)量的一種有效手段。在HMP途徑中，6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶的作用下，催化生成核糖-5-磷酸，進(jìn)而合成PRPP。因此，通過增強(qiáng)微生物的EMP途徑和TCA循環(huán)途徑以及提高6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）的活性能有效提高生物體能量的供給以及促進(jìn)PRPP的合成，進(jìn)而提高cAMP的產(chǎn)量。

VB1作為生物體內(nèi)參與能量代謝的多種酶的輔因子［6］，能夠有效提高碳代謝途徑中酶的活性，在生物體的碳代謝循環(huán)中起到了至關(guān)重要的作用。因此，筆者從cAMP合成的代謝途徑出發(fā)，研究VB1的添加對(duì)Arthrobacter sp.A302菌體的生長(zhǎng)及cAMP產(chǎn)量的影響，通過檢測(cè)胞內(nèi)ATP的水平，測(cè)定菌體在發(fā)酵過程中的幾種有機(jī)酸含量的變化以及幾種關(guān)鍵酶的活性改變，來初步探究VB1促進(jìn)cAMP產(chǎn)量提高的原因。

圖1 Arthrobacter A302cAMP合成圖Fig.1 Schematic illustration of the biosynthesis of cAMP by Arthrobacter A302

1 材料和方法

1.1 菌種

Arthrobacter sp.A302，南京工業(yè)大學(xué)國(guó)家生化中心應(yīng)漢杰教授課題組篩選保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，NaCl 3，瓊脂20。pH 7.2。

種子培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，NaCl 3。pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖40，K2HPO418，KH2PO45，MgSO40.1，尿素10，生物素0.003，CoCl20.005，NaCl 0.4，次黃嘌呤8。pH 7.0。

以上培養(yǎng)基都在121℃滅菌15 min后備用。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將-80℃冰箱保存菌種接種于斜面培養(yǎng)基活化，30℃培養(yǎng)48 h。斜面培養(yǎng)基上的菌苔接種于種子培養(yǎng)基，30℃、280 r／min搖床培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、280 r／min搖床培養(yǎng)72 h。以上種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均用500 mL搖瓶，裝液量為30 mL。

1.3.2 分析測(cè)定

cAMP采用液相檢測(cè)（HPLC，Agilent公司1200系統(tǒng)），C18柱（Lichrospher，4.6 mm×300 mm，5 μm），進(jìn)樣量20μL。流動(dòng)相為甲醇及磷酸三乙胺緩沖液（0.05 mmol／L），二者體積比為20∶80，流速為0.8 mL／min，25℃，254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。葡萄糖含量用SBA生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）檢測(cè)。細(xì)胞含量采用紫外分光光度計(jì)（Beckman公司）于660 nm條件下檢測(cè)濁度。蛋白質(zhì)檢測(cè)用考馬斯亮藍(lán)法。有機(jī)酸檢測(cè)為高效液相色譜法（Agilent1200 series），流動(dòng)相為3.0mLH2SO4，流速為0.4 mL／min，60℃，210 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。ATP濃度采用Glomax發(fā)光檢測(cè)儀（Promega公司）測(cè)定。酶活采用分光光度法測(cè)定［7］。

2 結(jié)果與討論

2.1 VB1對(duì)發(fā)酵過程中cAMP及生物量的影響

圖2為不同VB1對(duì)cAMP和生物量的影響結(jié)果。由圖2可知：在低濃度的條件下，cAMP的產(chǎn)量隨著VB1濃度的提高而增加；當(dāng)VB1的質(zhì)量濃度高于0.5 g／L，cAMP產(chǎn)量開始下降；當(dāng)VB1的質(zhì)量濃度為0.5g／L時(shí)，cAMP的產(chǎn)量達(dá)到最大值（7.5 g／L）。

圖2 VB1添加量對(duì)cAM P產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of VB1concentrations on cAMP production

發(fā)酵前期是菌體快速增長(zhǎng)的時(shí)期，發(fā)酵產(chǎn)物cAMP的產(chǎn)量與菌體的生長(zhǎng)情況密切相關(guān)，因此，檢測(cè)發(fā)酵過程中的菌體的生長(zhǎng)情況能間接反映出產(chǎn)物的產(chǎn)量高低。

考察添加0.5 g／L VB1對(duì)Arthrobacter sp.A302發(fā)酵性能的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：發(fā)酵24 h后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，cAMP大量積累。與對(duì)照組相比，發(fā)酵72 h結(jié)束后，細(xì)胞干質(zhì)量提高了41.8%，由5.5 g／L提高到7.8 g／L；cAMP產(chǎn)量從5.5 g／L提高到7.5 g／L，提高了36.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加VB1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著作用，與Chung等［8］研究的結(jié)果一致。一方面，VB1作為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的輔酶［9-10］，在丙酮酸的代謝過程中起到至關(guān)重要的作用，提高VB1的濃度能有效提高丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性，進(jìn)而加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)丙酮酸的利用，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。另一方面，作為一種轉(zhuǎn)酮醇酶的輔因子［9］，VB1也可能對(duì)磷酸戊糖途徑產(chǎn)生影響，磷酸戊糖途徑為微生物的生長(zhǎng)提供了大量的NADPH，NADPH含量的降低會(huì)抑制微生物細(xì)胞壁的合成［10］，因此，磷酸戊糖途徑代謝強(qiáng)度的大小與微生物的生長(zhǎng)息息相關(guān)。從以上幾方面可以看出，VB1與細(xì)胞的生長(zhǎng)具有密切聯(lián)系。

2.2 VB1對(duì)發(fā)酵過程中ATP含量的影響

對(duì)Arthrobacter sp.A302的cAMP代謝過程（圖1）的分析可知，cAMP是由ATP直接環(huán)化得到的產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)ATP水平的高低對(duì)cAMP的合成產(chǎn)生直接影響，其含量越高越有利于cAMP的合成。同時(shí)，在補(bǔ)救途徑中，PRPP是合成cAMP的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，ATP為PRPP的合成提供了能量。

圖3 添加0.5 g／L VB1對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of adding 0.5 g／L VB1on fermentation

考察添加VB1對(duì)發(fā)酵過程中ATP的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：添加VB1能明顯提高細(xì)胞內(nèi)ATP的水平。在發(fā)酵到12 h左右，ATP的含量達(dá)到了最高水平。在添加VB1的條件下，細(xì)胞中ATP的最高水平提高了35.50%。丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶都是VB1依賴酶［11-12］，丙酮酸脫氫酶能催化丙酮酸生成乙酰輔酶A，進(jìn)而參與到TCA循環(huán)途徑中；α-酮戊二酸脫氫酶更是TCA循環(huán)中的限速酶，催化α-酮戊二酸生成琥珀酰輔酶A。因此，在微生物利用丙酮酸代謝生成ATP的過程中，VB1起到很關(guān)鍵的作用。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，在動(dòng)物及人的TCA循環(huán)途徑中，酶的活性會(huì)隨著VB1的含量下降而降低［13］，這導(dǎo)致TCA循環(huán)的強(qiáng)度減弱，降低了細(xì)胞內(nèi)ATP的合成。

圖4 VB1對(duì)ATP的影響Fig.4 Effects of VB1on ATP concentration

2.3 VB1對(duì)發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的影響

TCA循環(huán)為生物的生長(zhǎng)提供了主要的能量，對(duì)生物的生長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用。在TCA循環(huán)中產(chǎn)生的多種有機(jī)酸可作為代謝中間產(chǎn)物參與到機(jī)體代謝的許多方面。因此，對(duì)TCA循環(huán)中產(chǎn)生的有機(jī)酸的測(cè)定也能反映出生物代謝活動(dòng)的強(qiáng)度。表1為發(fā)酵過程中琥珀酸、α-酮戊二酸和乙酸的質(zhì)量濃度變化結(jié)果。由表1可知：在發(fā)酵24 h時(shí)琥珀酸和α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，添加VB1后，琥珀酸和α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度平均提高了43.59%和40.77%。在培養(yǎng)基中添加VB1能提高α-酮戊二酸脫氫酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)TCA循環(huán)，增加琥珀酸和α-酮戊二酸的積累。另外，在cAMP的合成途徑中，乙酸是由丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛再氧化得到一種重要的副產(chǎn)物。從表1還可以看出，與對(duì)照相比，VB1對(duì)乙酸的合成沒有明顯影響，即在cAMP的合成過程中沒有過多的副產(chǎn)物累積。乙酸代謝途徑是合成丙酮酸的主要競(jìng)爭(zhēng)途徑［14］，乙酸含量越高說明進(jìn)入TCA循環(huán)途徑的丙酮酸量越少。因此，乙酸含量的高低直接關(guān)系到Arthrobacter sp.A302在合成cAMP的過程中對(duì)丙酮酸的有效利用。

表1 VB1對(duì)有機(jī)酸的影響Table 1 Effects of VB1on organic acid production

2.4 VB1對(duì)代謝過程中關(guān)鍵酶活的影響

磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PYK）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）這3種酶在cAMP的合成過程（圖1）中起到關(guān)鍵性的作用。因此考察添加VB1對(duì)cAMP代謝過程中關(guān)鍵酶活的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知：在發(fā)酵過程中，PFK的活性呈現(xiàn)出先下降再上升再下降的趨勢(shì)；相比于對(duì)照組，添加VB1后使PFK活性提高的時(shí)間提前，酶活平均提高了32.92%。不添加VB1的條件下，PYK的活性在初期會(huì)下降；添加VB1后，PYK的酶活平均提高了20.23%。相比于對(duì)照組，添加VB1對(duì)G6PDH的活性有明顯的提升效果，其活性平均提高了49.62%。VB1作為多種酶的輔酶，在生物的碳代謝過程中發(fā)揮重要的作用。作為PFK和PYK的輔酶，在培養(yǎng)基中添加VB1能有效提高這2種酶的活性，Xu等［15］在研究乳酸發(fā)酵的過程中也發(fā)現(xiàn)了VB1對(duì)PFK等酶活力的促進(jìn)作用；另外，作為一種轉(zhuǎn)酮醇酶的輔因子，VB1同時(shí)也能提高G6PDH的活性［9］。

3 結(jié) 論

VB1對(duì)Arthrobacter sp.A302合成cAMP的產(chǎn)量具有顯著影響，添加的最佳質(zhì)量濃度為0.5 g／L；搖瓶發(fā)酵cAMP的最高產(chǎn)量達(dá)到7.5 g／L，同時(shí)，細(xì)胞干質(zhì)量也有明顯增加，最高可達(dá)7.8 g／L；添加VB1能有效加強(qiáng)EMP途徑及TCA循環(huán)，為細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝及cAMP的合成提供更多的能量；與對(duì)照相比，細(xì)胞中PFK、PYK及G6PDH 3種酶的活性得到明顯提高。

圖5 VB1對(duì)PFK、PYK和G6PDH比酶活的影響Fig.5 Effects of VB1on PFK，PYK，and G6PDH enzyme activities

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Effects of thiam in on production of cyclic adenosinemonophosphate by Arthrobacter sp.A302

YAO Shiwei，NIU Huanqing，CHEN Yong，YING Hanjie

（State Key Laboratory of Materials?Oriented Chemical Engineering，College of Life Science and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

The effects of addition of thiamine（VB1）on cyclic adenosine monophosphate（cAMP）production by Arthrobacter sp.A302 were investigated.The results showed that the addition of 0.5 g／L VB1was optimum for cAMP production and cell growth.The cAMP yield and the biomass reached 7.5 g／L and 7.8 g／L，and they were improved by 36.4%and 41.8%，respectively，compared with the control.The concentrations of succinic acid andα?ketoglutarate increased by 43.59%and 40.77%，and the production of acetic acid had no obvious change by addition 0.5 g／L VB1.The addition of VB1also affected the content of intracellular ATP and activities of several enzymes closely related to biosynthesis of cAMP.

Thiamine（VB1）；cAMP；Arthrobacter

Q814

A

1672-3678（2013）06-0019-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.004

2012-11-15

國(guó)家杰出青年基金（21025625）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA021203）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2011CBA00806）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（21106070）；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新發(fā)展計(jì)劃（PCSIRT）；江蘇省自然科學(xué)基金（SBK201150207）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD）

要世偉（1987—），男，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，研究方向：生物工程、發(fā)酵工程；陳 勇（聯(lián)系人），助理研究員，E?mail：chenyong1982＠njut.edu.cn