不同萃取體系對小球藻藻渣成分的影響

尹豐偉，段 珺，高 振，鄭洪立，鄭艷萍，黃 和，2

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京211800；

2.南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國家重點實驗室，南京210009）

不同萃取體系對小球藻藻渣成分的影響

尹豐偉1，段 珺1，高 振1，鄭洪立1，鄭艷萍1，黃 和1，2

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京211800；

2.南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國家重點實驗室，南京210009）

考察5種萃取體系（A：正己烷，B：正己烷／乙醇，C：正己烷／異丙醇，D：氯仿／甲醇，E：氯仿／乙醇）對小球藻（Chlorella phyrenoidosa）油脂的提取效果及藻渣成分的影響。實驗結(jié)果表明：不同的萃取體系下，油脂得率為D（12.27%）、E（8.87%）、C（7.71%）、B（6.80%）、A（3.91%），藻渣蛋白含量為A（52.60%）、E（46.23%）、B（40.19%）、C（39.52%）、D（32.52%），藻渣碳水化合物含量為A（23.28%）、E（16.15%）、B（13.24%）、D（13.50%）、C（9.06%）；藻渣色素含量為A（1.75%）、E（1.29%）、B（1.14%）、C（0.96%）、D（0.58%）；藻渣灰分含量為D（3.63%）、E（2.94%）、C（2.23%）、B（2.25%）、A（1.48%）。綜合考慮微藻生物柴油的生產(chǎn)及藻渣的可利用性，V（氯仿）／V（乙醇）＝1是一種油脂萃取效果較好，藻渣營養(yǎng)成分損失較小的小球藻油脂萃取體系。

小球藻；萃取；油脂；微藻；營養(yǎng)成分

當(dāng)前，由于全球能源、資源和環(huán)境壓力，使研究者的目光投向了對生物質(zhì)資源的開發(fā)與利用［1］，在眾多的生物質(zhì)原料中，微藻光合效率高、生長速度快、油脂含量高，具有開發(fā)成生物柴油原料的潛能［2］，但因生產(chǎn)成本高［3］，未能實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。微藻柴油生產(chǎn)中，油脂的提取是其中一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有機溶劑萃取法因成本較低、溶劑可回收利用等優(yōu)勢［4］，是微藻油脂提取中的常用方法。前人關(guān)于微藻油脂的提取做了大量研究，并針對不同的微藻提出了不同的有機溶劑萃取體系和提取方法［5-7］，其中以混合萃取體系（極性與非極性有機溶劑混合）的提取效果最好［8］。微藻除了含有可供生產(chǎn)生物柴油的油脂外，還含有大量的蛋白、多糖、色素、礦質(zhì)元素等，因此藻渣中會殘留豐富的營養(yǎng)成分，并且微藻油脂提取后會產(chǎn)生50%～80%的藻渣［9］。有報道指出將微藻油脂生產(chǎn)和藻渣的利用結(jié)合起來是降低生物柴油生產(chǎn)成本的有效途徑之一［10］，同時也可避免藻渣堆積帶來的環(huán)境污染。

雖然有關(guān)微藻油脂提取方面的研究已取得很大的進展，但這些研究很少涉及并考慮到不同萃取方法對提油之后藻渣的影響。針對該問題，筆者擬在前人研究的基礎(chǔ)上，綜合目前實驗中常用的萃取體系，考察不同萃取體系對蛋白核小球藻（Chlorella phyrenoidosa）藻渣成分的影響，為小球藻油脂的提取和藻渣利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 小球藻

實驗所用的蛋白核小球藻（Chlorella phyrenoidosa）由筆者所在課題組培養(yǎng)。

1.2 油脂的提取

根據(jù)前人研究，擬采用5種不同的萃取體系（所用的試劑均為分析純，以后皆用A～E表示）：A正己烷［11］，B正己烷／乙醇（體積比1∶1）［6］，C正己烷／異丙醇（體積比1∶1）［7］，D氯仿／甲醇（體積比1∶1）［5］，E氯仿／乙醇（體積比1∶1，由筆者根據(jù)文獻［8］提出）。

稱2 g藻粉，液氮破壁［6］后收集于50 mL具塞三角瓶中，分別加入20 mL A～E的萃取體系，25℃、200 r／min條件下振蕩萃取2 h.萃取結(jié)束后加10 mL蒸餾水分層［8］，分別取正己烷層和氯仿層于25 mL圓底燒甁中，并再用相同體積的正己烷和氯仿萃取2次。有機溶劑經(jīng)減壓蒸餾去除，即得粗油脂，具體流程見圖1。

圖1 小球藻油脂的提取與藻渣獲取路線Fig.1 Roadmap of lipid extraction and algae?residues obtained from C．phyrenoidosa

1.3 藻渣的獲得

油脂提取之后，將剩下的含小球藻細胞碎片的藻液離心（在4℃下5 000 r／min離心10 min）棄上清，細胞碎片再用蒸餾水洗3次，收集沉淀，60℃烘干，即得藻渣（圖1）。

1.4 分析方法

油脂得率的計算及脂肪酸分析參照文獻［6］。蛋白質(zhì)的測定參照文獻［12］，以6.25作為總N轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

氨基酸測定：稱取0.02 g藻渣于10 mL水解管中，加10 mL 6 mol／L HCl，120℃條件下水解24 h。氨基酸的分析方法參照文獻［13］。

藻渣碳水化合物的測定采用H2SO4蒽酮法［14］。

藻渣色素的提取與分析參照文獻［15］。

藻渣灰分的測定參照文獻［16］。

藻渣礦質(zhì)元素的分析：藻渣灰化后以1∶49（體積比）的HNO3溶解后，進行ICP分析［17］。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取體系對油脂得率的影響

考察萃取體系對油脂得率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知：小球藻的油脂約占細胞干質(zhì)量的10%，不同的萃取體系下的油脂得率差異明顯；單一非極性有機溶劑（A）下的油脂得率最少，只有3.91%，混合萃取體系下油脂的得率較高，其中D條件下可達到12.27%。Halim等［11］發(fā)現(xiàn)正己烷／異丙醇條件下獲得的油脂要比單一的正己烷條件下多3倍左右，并提出了微藻油脂的萃取機制［8］，認為極性和非極性有機溶劑可針對不同類型油脂的萃取，而混合萃取體系更利于微藻油脂的萃取，原因與細胞中同膜蛋白相連的油脂相關(guān)。這是因為藻細胞含有極性脂，并通過氫鍵或其他較強的靜電鍵與膜上的蛋白質(zhì)相連，萃取體系中的極性溶劑可以破壞這種連接［11］，將這類脂從膜蛋白上“拉”出來并溶于有機溶劑中。本實驗進一步證實了該機制，并發(fā)現(xiàn)不同非極性／極性有機溶劑組合變化對油脂的提取效果不同。

圖2 萃取體系對小球藻的油脂得率的影響Fig.2 Effects of extraction system s on lipid yield of C．phyrenoidosa

2.2 萃取體系對脂肪酸分布的影響

表1為萃取體系對脂肪酸分布的影響結(jié)果。由表1可知：該蛋白核小球藻的脂肪酸類型分布為C14∶0～C18∶3，不飽和脂肪酸（UFA）含量較高，約占總脂肪酸的77%；所有脂肪酸中，以C18∶2（亞油酸）、C16∶0（軟脂酸）和C18∶3（亞麻酸）的含量較高。由表1還可以看出，不同萃取體系下得到的脂肪酸具有明顯的差別：單一正己烷條件（A）不利于飽和脂肪酸的提取，飽和脂肪酸（SFA）占總脂肪酸的21.04%，這可能是由于不飽和脂肪酸多以極性結(jié)構(gòu)脂的形式存在有關(guān)；其他4種混合萃取體系，以B得到的飽和脂肪酸比例較高，達到總脂肪酸的24.43%，以C條件下的最少，為22.74%。這說明油脂在細胞內(nèi)有不同存在形式，且進一步說明不同的萃取體系對細胞內(nèi)油脂的作用力不同。

表1 萃取體系對小球藻的脂肪酸分布及含量的影響Table 1 Effects of extraction system s on the fatty acid composition and contents in C．phyrenoidosa

2.3 萃取體系對藻渣蛋白含量的影響

圖3為不同萃取條件下藻渣的蛋白含量結(jié)果。由圖3可知：該小球藻藻渣中的蛋白質(zhì)占到藻渣干質(zhì)量的45%左右，可作為一種良好的蛋白食品或蛋白飼料源；A條件下的藻渣蛋白含量較高，占藻渣干質(zhì)量的52.60%，D條件下得到的最少，為32.52%。本實驗采用液氮研磨對細胞進行破壁處理［6］，因此細胞膜上的極性脂與蛋白的復(fù)合體有可能在萃取時一并進入到有機溶劑中，造成藻渣蛋白含量的減少。另外，混合萃取體系中的極性溶劑（水醇相）含有色素、蛋白質(zhì)、氨基酸和其他的非油脂成分［18］，造成部分蛋白質(zhì)的流失。實驗中所用到的幾種極性溶劑極性各不相同，可能會造成不同萃取體系中的水醇相蛋白含量不同。因此，藻渣蛋白含量受多種因素影響，具體原因和機制有待進一步深入研究。

2.4 萃取體系對藻渣的氨基酸組成及含量的影響

表2為藻渣中的氨基酸及其含量。由表2可知：4種混合萃取體系（B～E）下的氨基酸含量相似，但單一萃取體系（A）與混合萃取體系（B～E）相比在某些氨基酸含量上具有較大差異，這可能與萃取過程中因萃取體系不同而造成的蛋白質(zhì)流失有關(guān)。

圖3 萃取體系對藻渣的蛋白含量的影響Fig.3 Effects of extraction systems on protein contents in algae?residues

表2 萃取體系對藻渣中氨基酸的組成及含量的影響Table 2 Effects of extraction system s on am ino acid compositions and content of algae?residues

2.5 萃取體系對藻渣的碳水化合物含量的影響

圖4為不同萃取體系下的藻渣中碳水化合物含量結(jié)果。由圖4可知：小球藻細胞中含有較多的糖脂（glycolipid），約占細胞干質(zhì)量的5.7%［19］。糖脂作為一種極性脂是膜脂的重要組成成分［20］，在油脂的萃取過程中一部分糖脂溶于有機溶劑而被提取出來，使藻渣中的碳水化合物含量降低。另外，小球藻的部分碳水化合物因溶于水醇相中而流失［18］，也會降低藻渣碳水化合物的含量。從圖4還可以看出，混合萃取體系對藻渣碳水化合物的含量影響較大，且不同的混合萃取體系之間也有較大差別。

圖4 萃取體系對藻渣的碳水化合物含量的影響Fig.4 Effects of extraction systems on content of total carbohydrate in algae?residues

2.6 不同萃取體系下的藻渣色素含量

不同萃取體系下藻渣中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量變化如圖5所示。由圖5可知：A條件下的藻渣色素含量最多，達到17.51mg／g；其次為B、C和E，三者相差不大；D條件下最少，為5.59 mg／g。將該結(jié)果與2.1節(jié)結(jié)果對照可知，油脂萃取效果好的體系同樣對色素有著良好的萃取作用，這主要是因為這3種色素都是脂溶性的，在油脂的萃取過程中溶于有機溶劑而使藻渣中的色素含量降低。有研究表明氯仿／甲醇體系利于葉綠素a的提?。?1-22］，本實驗的結(jié)果也表明了這一點，并且還證明該體系同時還適用于另外2種色素的萃?。▓D5）。藻渣中色素含量的差異也說明不同萃取體系對微藻不同色素的作用力不同。

圖5 萃取體系對藻渣的色素含量的影響Fig.5 Effects of extraction system s on pigment contents in algae?residues

2.7 萃取體系對藻渣的灰分含量的影響

不同萃取體系下的藻渣中灰分含量如圖6所示。由圖6可知：藻渣中的灰分含量較少；不同萃取體系下的藻渣灰分含量不同，以D條件下得到的灰分最多，占到藻渣干質(zhì)量的3.36%?；曳种饕菬o機成分的殘留物，本實驗獲取的藻渣是破壁后的小球藻經(jīng)水和有機溶劑處理后的殘余物，為藻細胞的結(jié)構(gòu)成分（細胞器、細胞膜和細胞壁等），胞內(nèi)游離無機鹽易在處理過程中流失。而灰分含量的測定是以占干質(zhì)量的百分比計算的，而由前面的分析可知，A條件下的油脂得率最低，藻渣中殘留的油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物的含量最高，使得灰分在總干質(zhì)量中所占的比例降低；D條件則恰好相反。

圖6 萃取體系對藻渣的灰分含量的影響Fig.6 Effects of extraction system s on ash content in algae residues

2.8 萃取體系對藻渣中礦質(zhì)元素含量的影響

分析了不同萃取體系下藻渣中的9種礦質(zhì)元素（P、Ca、Na、K、Fe、Al、Zn、Cu和Mn），結(jié)果如表3所示。由表3可知：藻渣中含有豐富的P、Ca和Na，分別占到礦質(zhì)元素總質(zhì)量的50%、20%和15%左右，Al、Zn、Cu和Mn的含量則相對較少。9種元素中，P含量具有顯著的優(yōu)勢，這是因為藻渣主要是殘破的細胞結(jié)構(gòu)，而P又是細胞核和細胞膜等細胞結(jié)構(gòu)的重要組成元素。不同萃取體系下，藻渣礦質(zhì)元素占藻渣干質(zhì)量的含量（mg／g）由多到少依次為D（869.19）、E（656.98）、B（548.98）、C（483.78）、A（424.70），此趨勢同藻渣灰分的含量趨勢一致（圖6），這是因為礦質(zhì)元素是灰分的主要成分。

2.9 萃取體系的評價

綜合以上實驗結(jié)果，針對微藻生物柴油的生產(chǎn)和藻渣的可利用性，并參照美國能源部關(guān)于微藻生物煉制的概述［23］，對油脂和藻渣成分各項指標分配權(quán)重。其中油脂的獲得是主要目標，因此給以最高權(quán)重值為0.3，藻渣中的成分根據(jù)其經(jīng)濟價值分別賦予不同的權(quán)重（表4），并為各種萃取體系打分（相差不明顯的計相同分）。在該評價方法下，E萃取體系得到的分數(shù)最高為4.0，其次為A（3.8）和D（3.2），得分最少的為B（2.8）和C（2.4）。因此在該評價方法下，E萃取體系（氯仿／乙醇）獲得的油脂得率較高，且藻渣成分損失較少。

表3 萃取體系對藻渣中的礦質(zhì)元素含量的影響Table 3 Effects of extraction system s on m ineral contents in algae?residues

表4 萃取體系的評價Table 4 Evaluation of extraction systems

3 結(jié) 論

油脂萃取后的小球藻（Chlorella phyrenoidosa）藻渣中仍含有豐富的營養(yǎng)成分，具有進一步開發(fā)利用的潛力。單一非極性有機溶劑不利于油脂的萃取，但得到的藻渣營養(yǎng)成分損失最少；混合萃取體系由于其極性溶劑能破壞極性脂與膜的連接，因此更能充分提取細胞中的油脂成分，但同時也造成藻渣成分損失較多——一部分溶于水醇相中而流失，另一部分溶于非極性溶劑中，具體的組成及含量有待于進一步研究。不同的混合萃取體系由于極性的不同對油脂的提取效果和藻渣成分的影響也不同，氯仿／乙醇（體積比1∶1）體系相對是一種提油效果較好、藻渣營養(yǎng)成分損失較小的萃取體系，但由于氯仿的使用可能會限制藻渣的進一步利用，因此針對微藻及藻渣的利用方向可選擇不同的萃取體系，另外開發(fā)一種有效的有機溶劑去除方法也可以拓寬藻渣的應(yīng)用范圍。

［1］ Lang X，Dalai A K，Bakhshi N N，et al.Preparation and characterization of bio?diesels from various bio?oils［J］.Bioresour Technol，2001，80（1）：53?62.

［2］ Wijffels R H，Barbosa M J.An outlook on microalgal biofuels［J］.Science，2010，329：796?799.

［3］ Li Y G，Xu L，Huang Y M，et al.Microalgal biodiesel in China：opportunities and challenges［J］.Appl Energy，2011，88（10）：3432?3437.

［4］ Mercer P，Armenta R E.Developments in oil extraction from microalgae［J］.Eur J Lipid Sci Technol，2011，113（5）：539?547.

［5］ Lee JY，Yoo C，Jun SY，etal.Comparison of severalmethods for effective lipid extraction from microalgae［J］.Bioresour Technol，2010，101（1）：S75?S77.

［6］ Zheng H，Yin J，Gao Z，etal.Disruption of Chlorella vulgaris cells for the release of biodiesel?producing lipids：a comparison of grinding，ultrasonication，bead milling，enzymatic lysis，and microwaves［J］.Appl Biochem Biotechnol，2011，164（7）：1215?1224.

［7］ Grima E M，Medina A R，Gim nez A G，et al.Comparison between extraction of lipids and fatty acids from microalgal biomass［J］.JAm Oil Chem Soc，1994，71（9）：955?959.

［8］ Halim R，Danquah M K，Webley P A.Extraction of oil from microalgae for biodiesel production：a review［J］.Biotechnol Adv，2012，30（3）：709?732.

［9］ Milledge J J.The challenge of algal fuel：economic processing of the entire algal biomass［J］.Condensed Matter，2010，1（6）：4?6.

［10］ Vasudevan P T，Briggs M.Biodiesel production：current state of the art and challenges［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2008，35（5）：421?430.

［11］ Halim R，Gladman B，Danquah M K，et al.Oil extraction from microalgae for biodiesel production［J］.Bioresour Technol，2011，102（1）：178?185.

［12］ 衛(wèi)生部.GB 5009.5—2010食品中蛋白質(zhì)的測定［M］.北京：中國標準出版社，2010.

［13］ 史純珍，張紅漫，黃和，等.米根霉胞內(nèi)氨基酸的高效液相色譜測定及其代謝途徑分析［J］.分析化學(xué)，2012，40（4）：574?578.

［14］ Morris D L.Quantitative determination of carbohydrates with Dreywood＇s anthrone reagent［J］.Science，1948，107：254?255.

［15］ Wellburn R.The spectral determination of chlorophylls a and b，as well as total carotenoids，using various solvents with spectrophotometers of different resolution［J］.J Plant Physiol，1994，144（3）：307?313.

［16］ 衛(wèi)生部.GB 5009.4—2010食品中灰分的測定［M］.北京：中國標準出版，2010.

［17］ Li X，Coles B J，Ramsey M H，et al.Sequential extraction of soils formultielementanalysis by ICP?AES［J］.ChemiGeol，1995，124（1／2）：109?123.

［18］ Fajardo A R，Cerdán L E，Medina A R，et al.Lipid extraction from the microalga Phaeodactylum tricornutum［J］.Eur J Lipid Sci Technol，2007，109（2）：120?126.

［19］ Murakami C，Takahashi J，Shimpo K，et al.Lipids and fatty acid compositions of Chlorella［J］.JJpn Oil Chem Soc，1997，46：423?428.

［20］ Liu J，Huang J，Sun Z，et al.Differential lipid and fatty acid profiles of photoautotrophic and heterotrophic Chlorella zofingiensis：assessment of algal oils for biodiesel production［J］. Bioresour Technol，2011，102（1）：106?110.

［21］ Wood LW.Chloroform?methanol extraction of chlorophyll a［J］. Can JFish Aquat Sci，1985，42（1）：38?43.

［22］ Lloyd SW，Tucker C S.Comparison of three solvent systems for extraction of chlorophyll a from fish pond phytoplankton communities［J］.JWorld Aquacult Soc，2007，19（2）：36?40.

［23］ USDOE.National algal biofuels technology roadmap［EB／OL］.［2012?10?08］.http：／／www1.eere.energy.gov／bioenergy／pdfs／algal＿biofuels＿roadmap.pdf.

Effects of extraction system s on com positions of oil?extracted algae?residues from Chlorella phyrenoidosa

YIN Fengwei1，DUAN Jun1，GAO Zhen1，ZHENG Hongli1，ZHENG Yanping1，HUANG He1，2

（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211800，China；2.State key Laboratory of Materials?Oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

The effects of five kinds of extraction systems（A：n?hexane，B：n?hexane／alcohol，C：n?hexane／isopropyl，D：chloroform／methanol，E：chloroform／alcohol）on lipid extraction and nutrient compositions of algae?residues from Chlorella phyrenoidosa were studied.By different extraction systems，the lipid yield were：D（12.27%），E（8.87%），C（7.71%），B（6.80%），A（3.91%）；the crude protein content of algae?residueswere：A（52.60%），E（46.23%），B（40.19%），C（39.52%），D（32.52%）；the total carbohydrates of algae?residueswere：A（23.28%），E（16.15），B（13.24%），D（13.50），C（9.06%）；the pigments contents of algae?residues were：A（1.75%）），E（1.29%），B（1.14%），C（0.96%），D（0.58%）；the ash contents of algae?residueswere：D（3.36%），E（2.94%），C（2.23%），B（2.25%），A（1.48%）.The extraction system V（chloroform）／V（alcohol）＝1 was suitable for microalgae lipid extraction because of its higher lipid yield and much less influence on nutrient composition of algae?residues.

Chlorella phyrenoidosa；extraction；lipid；microalgae；nutrient composition

Q819

A

1672-3678（2013）06-0009-06

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.002

2012-10-10

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CB200906）

尹豐偉（1985—），男，山東青島人，碩士研究生，研究方向：生物化工；高 振（聯(lián)系人），副研究員，E?mail：gaozhen＠njut.edu.cn