液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定干海參中硝基呋喃代謝物殘留量

郭無瑕,李肖斐

(大連標準檢測技術(shù)研究中心,遼寧大連116021)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定干海參中硝基呋喃代謝物殘留量

郭無瑕,李肖斐

(大連標準檢測技術(shù)研究中心,遼寧大連116021)

建立了檢測干海參中4種硝基呋喃代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。將干海參樣品經(jīng)過鹽酸水解,以2-硝基苯甲醛(2-NBA)為衍生劑,經(jīng)HLB固相萃取凈化后,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ESI+)MRM檢測,同位素內(nèi)標定量。結(jié)果表明:4種硝基呋喃代謝物的線性范圍均為0.5～10.0 μg/L,檢出限均為0.5 μg/kg,3個水平的加標回收率為76.4% ～88.4%。該方法穩(wěn)定性強、重現(xiàn)性好,能滿足干海參中4種硝基呋喃代謝物殘留檢測的要求。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;干海參;硝基呋喃代謝物

隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展和人們保健意識的增強,海參的消費量急劇增加,而自然養(yǎng)殖海域的極大減少又刺激了海參養(yǎng)殖的快速和無序發(fā)展,導(dǎo)致其病害不斷發(fā)生。海參養(yǎng)殖過程中長期施用抗生素,不僅會導(dǎo)致動物機體免疫力下降,而且還會因藥物殘留而危害食用者的健康。硝基呋喃類藥物是一類合成的抗菌藥物,因其價格低廉且療效佳,被廣泛用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]。研究表明,此類藥物及其代謝產(chǎn)物AOZ、AMOZ、SEM和AHD均可使實驗動物發(fā)生癌變和基因突變,對人的健康造成危害[2]。歐盟和美國分別在1995、2002年全面禁止將該類藥物用于食源性動物。中國也于2002年規(guī)定在所有食用動物養(yǎng)殖中禁止使用硝基呋喃類藥物[3]。硝基呋喃類藥物在生物體內(nèi)代謝迅速,無法檢測,而其代謝物因與蛋白質(zhì)結(jié)合相對穩(wěn)定,故主要利用其代謝物檢測硝基呋喃類藥物的殘留狀況[4]。硝基呋喃代謝物的檢測方法主要有液相色譜法[5]、酶聯(lián)免疫法[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等,目前關(guān)于獸肉、鮮水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物檢測方法的研究較多[8-10],但關(guān)于干海參中硝基呋喃代謝物檢測方法的研究國內(nèi)尚未見報道。本研究中,作者建立了干海參中4種硝基呋喃代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,并對樣品處理方法、色譜條件、質(zhì)譜條件等進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗儀器主要有XEVO液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司)、Autogizer均質(zhì)儀(Tomtec公司)、SHA-C恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)、3-30K型冷凍離心機(Sigma公司)。

試驗藥品主要有SEM、AOZ、AHD、AMOZ標準品(Dr.Ehrenstorfer公司),SEM-13C-15N、AOZD4、AHD-13C3、AMOZ-D5內(nèi)標標準品(Witega公司),2-硝基苯甲醛(百靈威科技有限公司),固相萃取柱HLB(Waters公司,3 mL,60 mg)。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,其余試劑均為分析純。試驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取8種標準品,用純甲醇溶解并分別稀釋成100 μg/mL的儲備液。將SEM、AOZ、AHD、AMOZ標準品溶液用50%(體積分數(shù),下同)的甲醇溶液稀釋成1 μg/mL的混合中間工作溶液;4種內(nèi)標溶液用50%的甲醇溶液配制成20 μg/L的混合溶液。

1.2.2 色譜和質(zhì)譜條件色譜條件色譜柱Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm1.7 μm),柱溫為40℃;流動相為超純水(含0.1%甲酸)和乙腈(含 0.1%甲酸);梯度洗脫,流速為 0.3 mL/min,進樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件電離方式有電噴霧電離(ESI)和正離子模式;霧化氣溫度為200℃,霧化氣流速為800 L/h,反吹氣流速為150 L/h;離子源溫度為150℃,毛細管電壓為1.5 kV;采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)(表1)。

表1 硝基呋喃代謝物的質(zhì)譜測定參數(shù)Tab.1 Parameters of mass spectrometry for detection of nitrofuran metabolites

1.2.3 樣品處理 準確稱取1.0 g干海參樣品置于離心管中,加入100 μL 20 μg/L的內(nèi)標混合溶液和20 mL 0.2 mol/L的HCl,使溶液中鹽酸的量為0.2 mmol/mL(必要時用濃鹽酸調(diào)節(jié)),再加入0.5 mL新配制的0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛(2-NBA)溶液,均質(zhì)后于37℃水浴中振蕩過夜。取出后加入2 mL 0.1 mol/L K2HPO4溶液,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7.4,以12 000 r/min離心3 min。取上清液過固相萃取柱(HLB),依次用5 mL甲醇、10 mL水活化,當樣品全部通過固相萃取柱后用10 mL水洗滌,用真空泵將柱抽干。用4 mL乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液并將其在40℃下用氮氣吹干,用20%的乙腈溶液溶解并定容至1.0 mL,混勻后過0.2 μm有機相濾膜,以備測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理條件的優(yōu)化

干海參中硝基呋喃代謝物以蛋白結(jié)合物的形態(tài)存在于機體組織中,只有在酸性條件下通過水解才能釋放出來。樣品在酸水解過程中,溶液的pH值極大地影響水解和衍生效率。部分干海參樣品呈堿性,在加入鹽酸后會消耗一定量的鹽酸,導(dǎo)致酸度不夠、回收率較低。本試驗結(jié)果表明,當溶液中鹽酸的量達到0.2 mmol/mL時水解完全、回收率較高。因此,在實際檢測中處理呈堿性的海參樣品時應(yīng)使用濃鹽酸調(diào)節(jié),使溶液中鹽酸量達到 0.2 mmol/mL,這樣才能使樣品水解完全,重復(fù)性好。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

用色譜柱進行分離時待測物在3 min內(nèi)全部出峰。分別考察以乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、甲醇-水作為流動相,對靈敏度和分離度的影響。結(jié)果表明,采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫時,對4種硝基呋喃代謝物的衍生物有較好的色譜分離和分析靈敏度。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將4種硝基呋喃代謝物標準溶液1 μg/mL用2-硝基苯甲醛衍生,得到相應(yīng)的衍生溶液。采用流動注射方式以0.3 mL/min流速分別將4種硝基呋喃代謝物的衍生物注入離子源。在正離子檢測方式下分別對其進行一級質(zhì)譜分析得到母離子峰,再對母離子進行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描),得到碎片離子信息和二級質(zhì)譜圖,然后再對錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化,使母離子與特征碎片離子強度達到最大,確定最佳質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.4 線性范圍和檢出限

分別吸取適量的混合中間工作溶液,用50%甲醇稀釋, 使終濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mg/L,并加入100～120 mg/L的內(nèi)標混合溶液。以標準物質(zhì)濃度與內(nèi)標濃度比為橫坐標,以標準物質(zhì)峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標,進行線性回歸,得到各標準物質(zhì)的回歸方程和相關(guān)系數(shù),結(jié)果呈良好的線性關(guān)系;以噪音響應(yīng)的3倍來測定各標準物質(zhì)的檢出限,SEM、AOZ、AHD、AMOZ的檢出限均為0.5 mg/kg(表2)。

2.5 檢測方法的回收率和精密度

取空白干海參樣品進行3個水平的加標試驗,加標濃度分別為 0.5、1.0、4.0 mg/kg,按照“1.2.3”節(jié)中的方法處理樣品后進行測定,測得4種硝基呋喃類代謝物的平均回收率為76.4% ～88.4%,各組分的回收率和精密度結(jié)果見表2。表明該方法穩(wěn)定性強、重現(xiàn)性好,能滿足干海參中4種硝基呋喃類代謝物殘留檢測的要求。

綜上所述,本研究中建立的測定方法步驟簡單、回收率高、精密度良好,為干海參中硝基呋喃類代謝物殘留量的檢測提供了一個準確、易操作的科學(xué)方法,為政府執(zhí)法部門開展風(fēng)險監(jiān)控工作提供了有力的技術(shù)支持。

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[2]孫言春,張潔,牟振波,等.固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留研究[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標準,2011(2):54-59.

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Determination of antibiotics nitrofuran metabolites in dried sea cucumber by HPLC-MS/MS

GUO Wu-xia,LI Xiao-fei
(Dalian Center of Standard Detection Technology,Dalian 116021,China)

A method for detection of 4 metabolites of antibiotics nitrofuran was developed in dried sea cucumber by HPLC-MS/MS.Samples of the dried sea cucumber were hydrolyzed by hydrochloric acid and derived with 2-nitrobenzaldehyde,was purified by HLB solid-phase extraction,and analyzed by HPLC-MS/MS(ESI+)using multiple reaction monitoring(MRM)in which the quantitative analysis was carried out by isotope internal standard dilution technique.The metabolite levels of antibiotics nitrofuran were shown a good linear relationship over the concentration ranging from 0.5 μg/L to 10.0 μg/L,with the detection limit of 0.5 μg/kg,and average recovery from 76.4%to 88.4%,indicating that the method has strong stability,good reproducibility,and meet the requirements for detection of nitrofuran metabolites in dried sea cucumber.

HPLC-MS/MS;dried sea cucumber;nitrofuran metabolite

TS254.7

A

2013-10-10

國家質(zhì)檢總局科研計劃項目(2013QK176)

郭無瑕(1982-),女,碩士,工程師。E-mail:13591322829@139.com

2095-1388(2013)06-0614-03