不同倍性泥鰍鰭細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備方法的研究

劉博,李雅娟,李霞,隋燚,高養(yǎng)春,王玉生,馬辰

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

不同倍性泥鰍鰭細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備方法的研究

劉博,李雅娟,李霞,隋燚,高養(yǎng)春,王玉生,馬辰

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

以天然二倍體、雜交三倍體(4n♀×2n♂)和天然四倍體泥鰍Misgurnus anguillicaudatus的鰭組織為材料,對(duì)短期培養(yǎng)的消毒方法、秋水仙素的濃度(1.0、1.5、2.0 μg/mL)與處理時(shí)間(2、3、4 h)和低滲處理時(shí)間(30、40、50 min)等細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),及染色體標(biāo)本制備方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:選擇100 g/L的碘伏溶液殺菌效果良好,對(duì)于細(xì)胞生長影響較小,尤以處理15 min時(shí)的效果最明顯,細(xì)胞遷出迅速;在終止培養(yǎng)前3 h加入秋水仙素至終濃度為1.5 μg/mL,天然二倍體、雜交三倍體和天然四倍體泥鰍鰭細(xì)胞中期分裂相染色體眾數(shù)最高,分別為93.33%、90.00%、70.00%;25℃下低滲處理40 min時(shí),可以獲得大量圖像清晰、長度適中、分散良好、染色體數(shù)目完整的染色體中期分裂相。本研究中初步建立了以鰭組織培養(yǎng)法作為材料來源快速制備不同倍性泥鰍染色體標(biāo)本的方法。

泥鰍;天然四倍體;雜交三倍體;二倍體;鰭組織;染色體

染色體標(biāo)本的制備技術(shù),對(duì)于研究魚類的遺傳變異、分類與系統(tǒng)進(jìn)化、性別決定、雜交育種和環(huán)境污染檢測(cè)等具有重要意義[1]。由于魚類染色體較小,染色體數(shù)目較多,常規(guī)的固定切片和壓片方法很難制備高質(zhì)量的染色體標(biāo)本。低滲處理、空氣干燥和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用大大提高了對(duì)魚類染色體研究的水平[2]。目前,染色體標(biāo)本制備最常用的是活體注射PHA-秋水仙素法[3-4],該方法在操作上雖然簡(jiǎn)單易行,但材料來源必須通過解剖魚體獲得,而且可獲得的試驗(yàn)材料數(shù)量有限,不利于材料魚的保護(hù)及進(jìn)一步研究的開展。

泥鰍Misgurnus anguillicaudatus存在多倍體現(xiàn)象,據(jù)報(bào)道,日本產(chǎn)的泥鰍除二倍體(2n=50)外,在北海道北部有較高的三倍體(3n=75)泥鰍分布,但沒有發(fā)現(xiàn)天然四倍體泥鰍[5-10]。中國產(chǎn)的泥鰍存在二倍體、三倍體和四倍體[11-14]。近年來,作者對(duì)中國產(chǎn)的泥鰍在天然多倍體的分布[15]、體細(xì)胞染色體核型分析[16]、染色體帶型與 FISH研究[17]、減數(shù)分裂染色體行為[18]、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育[19]和生殖特性[20]等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。首次證實(shí)了中國產(chǎn)天然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的遺傳四倍體(4n=100),也是同源四倍體,能產(chǎn)生正常的2n配子(雌或雄)。同時(shí)利用天然四倍體泥鰍與二倍體泥鰍雜交制備了一種新型的雜交三倍體泥鰍,并對(duì)其早期的染色體數(shù)目、DNA含量等進(jìn)行了研究[21]。但由于試驗(yàn)材料稀少,常常使后續(xù)研究無法進(jìn)行,因此,活體制備染色體標(biāo)本十分必要。本研究中以天然二倍體、雜交三倍體(4n♀×2n♂)和天然四倍體泥鰍鰭組織為材料,對(duì)短期培養(yǎng)的消毒方法、秋水仙素的濃度與處理時(shí)間和低滲處理時(shí)間等細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),及染色體標(biāo)本制備方法進(jìn)行了研究,旨在為開展多倍體泥鰍遺傳育種研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

天然二倍體泥鰍選自大連市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),體質(zhì)量為7.14～9.24 g,體長為10.30～11.00 cm;雜交三倍體泥鰍(4n♀×2n♂)由大連海洋大學(xué)細(xì)胞遺傳與工程實(shí)驗(yàn)室繁育并暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱中,體質(zhì)量為13.25～15.10 g,體長為10.85～14.90 cm;天然四倍體泥鰍取自湖北省武漢市,體質(zhì)量為15.48～21.89 g,體長為14.90～15.60 cm。本試驗(yàn)中用到的泥鰍倍性均經(jīng)血紅細(xì)胞核測(cè)量、流式細(xì)胞儀檢測(cè)確定,3種倍性的泥鰍各使用5條。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)參照郭瑩等[22]的方法,并根據(jù)泥鰍的實(shí)際情況略作改進(jìn)。

將泥鰍置于含雙抗消毒淡水(1 000 IU/mL青霉素、1 000 μg/mL鏈霉素)中暫養(yǎng)16～24 h,以不添加和添加適量食鹽分別進(jìn)行消毒浸泡。浸泡10 h左右時(shí)換水1/2,加適量雙抗繼續(xù)消毒。將泥鰍麻醉后置于濕潤紗布上,在超凈工作臺(tái)上將鰭平展,用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精沿鰭條擦拭消毒。剪下魚鰭,分別用10、50、100、150 g/L的碘伏溶液消毒10、15、20 min,雙抗浸泡30 min,期間換液1～2次并不斷吹打,吸掉雙抗,用PBS和5%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基各漂洗一次。參考樊廷俊等[23]的方法,用0.5%的透明質(zhì)酸酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化30 min,最后用5%FBSDMEM/F12培養(yǎng)基充分吹打成細(xì)胞懸液后,種植于瓶底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中。16～24 h時(shí)補(bǔ)加培養(yǎng)基至3 mL/瓶。

將組織塊置于含CO2(體積分?jǐn)?shù)為5%,下同)的培養(yǎng)箱(25℃)中培養(yǎng),每隔5 d在Olympus倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 待泥鰍鰭細(xì)胞長成單層,并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶瓶底時(shí),吸出培養(yǎng)基,加入1 mL左右0.25%的胰酶作用2 min,待細(xì)胞變圓后棄掉胰酶,加入含血清的培養(yǎng)基,用彎頭吸管吹打成細(xì)胞懸液,然后平均分裝于兩個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于含CO2(5%)的培養(yǎng)箱(25℃)中培養(yǎng)。

1.2.3 染色體標(biāo)本的制備 細(xì)胞傳代培養(yǎng)至2代以后,選擇進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞為材料進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備。

1)秋水仙素濃度及處理時(shí)間。于終止細(xì)胞傳代培養(yǎng)前,添加秋水仙素溶液至終濃度分別為1.0、1.5、2.0 μg/mL,每組分別在含CO2(5%)的培養(yǎng)箱(25℃)中培養(yǎng)2、3、4 h。秋水仙素終止作用后,用胰酶(0.25%)消化法收集細(xì)胞于錐形離心管中,離心,棄上清,取沉淀,低滲處理40 min,固定,制片,鏡檢。

2)低滲處理時(shí)間。于細(xì)胞傳代培養(yǎng)結(jié)束前3 h,加秋水仙素至終濃度為1.5 μg/mL,用0.8%的檸檬酸鈉于25℃恒溫箱中分別低滲30、40、50 min,制片,鏡檢。每組隨機(jī)抽取40個(gè)分裂相,按照無交叉(交叉0次)、分散好(交叉1～3次)、分散較好(交叉4～6次)、分散差(交叉7次以上) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)單一因素分析法,對(duì)泥鰍鰭組織的初步消毒方法和影響染色體標(biāo)本制備的因素逐一篩選,每組設(shè)3個(gè)平行,將通過顯微鏡觀察到的普遍情況作為結(jié)論。

2 結(jié)果與分析

2.1 食鹽和碘伏對(duì)組織塊滅菌效果的比較

通過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),添加少量食鹽對(duì)于去除泥鰍體表黏液有一定作用。

在組織滅菌消毒處理中,使用碘伏溶液浸泡效果明顯。用10 g/L的碘伏溶液浸泡時(shí),對(duì)組織塊的滅菌效果最差,細(xì)胞全部染菌;用50 g/L的碘伏溶液處理時(shí),雖然有少量組織貼壁生長,在少數(shù)幾個(gè)組織邊緣可以觀察到遷出的細(xì)胞,但是由于數(shù)量極少,生長緩慢,不可取;用150 g/L的碘伏溶液浸泡,雖然殺菌效果顯著,但是大多數(shù)組織塊呈棉絮狀,基本沒有遷出細(xì)胞,說明對(duì)組織塊的損傷大;用100 g/L的碘伏溶液浸泡,殺菌效果良好,對(duì)于細(xì)胞生長影響較小,細(xì)胞遷出迅速,且長勢(shì)良好,效果最明顯(圖1)。

用100 g/L的碘伏溶液浸泡組織塊的過程中,設(shè)定10、15、20 min 3個(gè)處理時(shí)間進(jìn)行比較。結(jié)果表明,處理10 min和20 min時(shí),各組織的貼壁率和遷出率均低于15 min時(shí),而處理20 min時(shí)組織的遷出率明顯低于處理10 min時(shí)(圖1)。

圖1 碘伏濃度和處理時(shí)間對(duì)不同倍性泥鰍鰭組織貼壁率和遷出率的影響Fig.1 The effect of povidone-iodine concentrations and processing time on attachment rate and cell emigration of fin tissue in different ploid loach

選擇適當(dāng)濃度的碘伏溶液和適當(dāng)浸泡時(shí)間是影響組織塊殺菌消毒效果的關(guān)鍵因素。本研究結(jié)果表明,選擇100 g/L的碘伏溶液浸泡15 min時(shí),可以取得理想的殺菌效果,且不影響組織貼壁和細(xì)胞遷出(圖2)。

圖2 泥鰍鰭組織原代細(xì)胞Fig.2 Fin cells in first passage from loach

2.2 染色體標(biāo)本制備的條件

利用鰭組織培養(yǎng)獲得的3種不同倍性的鰭細(xì)胞進(jìn)行染色體標(biāo)本制備時(shí),秋水仙素濃度對(duì)染色體形態(tài)影響顯著。其中,秋水仙素終濃度為2.0 μg/mL時(shí),天然二倍體、雜交三倍體和天然四倍體泥鰍鰭細(xì)胞在秋水仙素作用3 h時(shí)形態(tài)一致,均呈現(xiàn)收縮過度,既短且粗的狀態(tài)(圖3-A、D、G);秋水仙素終濃度為1.0 μg/mL時(shí),3種倍性的泥鰍鰭細(xì)胞在秋水仙素作用3 h時(shí)形態(tài)也基本一致,共同表現(xiàn)為細(xì)線狀(圖3-B、E、H),只在4 h的處理時(shí)間中觀察到少數(shù)幾個(gè)中期分裂相;秋水仙素終濃度為1.5 μg/mL時(shí),3種倍性的泥鰍鰭細(xì)胞染色體形態(tài)較為正常(圖3-C、F、I)。

圖3 不同倍性泥鰍鰭細(xì)胞染色體的中期分裂相Fig.3 Metaphase of fin cells in different ploid loach

秋水仙素的作用時(shí)間對(duì)染色體形態(tài)也有明顯的影響。在秋水仙素終濃度為1.5 μg/mL時(shí),作用2、3、4 h時(shí)分別統(tǒng)計(jì)30個(gè)細(xì)胞的分裂相,并觀察形態(tài)較好的染色體所占的百分比。結(jié)果表明:秋水仙素作用時(shí)間為3 h時(shí),3個(gè)倍性的泥鰍鰭細(xì)胞分裂相正常的百分比均最高,天然四倍體長短臂臂比正常、輪廓清晰的眾數(shù)為70.00%,雜交三倍體的眾數(shù)為90.00%,而二倍體的眾數(shù)則高達(dá)93.33%(表1);作用時(shí)間為2 h和4 h時(shí),正常染色體所占百分比雖然也是較高的,但普遍低于處理時(shí)間為3 h時(shí)的眾數(shù)。

表1 秋水仙素作用不同時(shí)間下染色體形態(tài)的比較Tab.1 The chromosomal morphology in different colchicine processing time

本研究中發(fā)現(xiàn),低滲時(shí)間對(duì)染色體分散程度有顯著的影響。在25℃的恒溫培育箱中,低滲處理30 min時(shí),天然四倍體、雜交三倍體和天然二倍體的染色體交叉數(shù)≤3的細(xì)胞數(shù)分別占 42.5%、77.5%和82.5%;低滲處理40 min時(shí),天然四倍體、雜交三倍體和天然二倍體的染色體交叉數(shù)≤3的細(xì)胞數(shù)分別占77.5%、77.5%和85.0%;低滲處理50 min時(shí),天然四倍體、雜交三倍體和天然二倍體的染色體交叉數(shù)≤3的細(xì)胞數(shù)分別占92.5%、77.5%和95.0%(表2)。

表2 不同低滲時(shí)間下染色體分散程度的比較Tab.2 Comparison of chromosome dispersion during different hypotonic time

3 討論

3.1 食鹽和碘伏對(duì)泥鰍鰭組織的殺菌作用

添加食鹽在泥鰍養(yǎng)殖過程中是一種較為常用的殺菌、消毒和殺蟲方式,稀釋后直接潑灑在水中就可以起到殺菌的效果,對(duì)魚體本身的傷害也較小。食鹽可防治魚類細(xì)菌性疾病、水霉病和寄生蟲病等。本試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn),在泥鰍浸泡過程中,溶解適量食鹽可以祛除泥鰍體表的黏液,起到一定的殺菌效果。本試驗(yàn)中嘗試采用廣譜性的殺菌劑聚維酮碘溶液作為浸泡組織塊的消毒劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),聚維酮碘溶液消毒易于掌控時(shí)間,對(duì)細(xì)胞生長影響較小,效果較好。泥鰍體表黏液豐富,喜歡生活在湖泊、池塘、溝渠和水田底部富有植物碎屑等細(xì)菌富集的淤泥表層,因此,采用泥鰍鰭培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵是組織塊的消毒殺菌問題,本試驗(yàn)中采用100 g/L的碘伏浸泡15 min已達(dá)到初步殺菌的作用。高曉華等[25]研究證實(shí),聚維酮碘低毒,可用于異育銀鯽的養(yǎng)殖過程。另外,培養(yǎng)基的選擇和添加適量的生長因子也是原代培養(yǎng)啟動(dòng)的關(guān)鍵。本試驗(yàn)中原代培養(yǎng)72 h內(nèi)遷出的是上皮樣細(xì)胞,隨后遷出的是成纖維狀細(xì)胞,上皮樣細(xì)胞逐漸死亡并漂浮后被成纖維樣細(xì)胞取代且連接成單層細(xì)胞。Bejar等[26]研究認(rèn)為,上皮樣細(xì)胞的死亡可能與細(xì)胞壽命有關(guān),也可能與培養(yǎng)基缺少相關(guān)生長因子有關(guān)。

3.2 泥鰍鰭組織制備染色體條件的探究

3.2.1 秋水仙素對(duì)染色體制備的影響 染色體數(shù)目具有物種特異性,可以作為準(zhǔn)確的細(xì)胞種屬鑒定指標(biāo)。染色體核型分析需要分散良好并且顯色清晰的染色體中期相,通常是利用秋水仙素終止紡錘絲生成,使染色體停留在有絲分裂中期。在魚類染色體的制備中,秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)不同魚種而言差異性較大。李雅娟等[2]在魚類外周血淋巴細(xì)胞短期培養(yǎng)及染色體制備技術(shù)的研究中指出,秋水仙素處理的參考范圍為0.2～1.0 μg/mL,作用時(shí)間為2～6 h;樊廷俊等[27]利用20 μg/mL的秋水仙素在24℃下培養(yǎng)10 h,獲得了大菱鲆鰭細(xì)胞的中期分裂相;曾令兵等[28]用1 μg/mL的秋水仙素在28℃下作用13～15 h,獲得了斑點(diǎn)叉尾鮰腎臟細(xì)胞的中期分裂相;任國誠等[29]利用0.5 μg/mL的秋水仙素在24℃下作用4 h,獲得了漠斑牙鲆囊胚期胚胎細(xì)胞染色體中期分裂相;李運(yùn)東等[30]在革胡子鯰全血細(xì)胞終止培養(yǎng)前6 h,加入終濃度為0.1 μg/mL的秋水仙素,獲得較多的分裂相且染色體形態(tài)清晰;朱香萍等[4]在牙鲆外周血淋巴細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)前4 h,加入終濃度為1.5 μg/mL的秋水仙素,獲得的中期分裂相效果最好。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:秋水仙素終濃度為1.0 μg/mL時(shí),作用時(shí)間為2、3 h,甚至4 h,細(xì)胞分裂較少,且染色體形態(tài)呈細(xì)線狀,說明沒有到達(dá)有絲分裂中期;秋水仙素終濃度為2.0 μg/mL時(shí),鏡下觀察染色體過度收縮,變短變粗,且時(shí)間不易于控制;在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前3 h加秋水仙素至終濃度為1.5 μg/mL時(shí),獲得了較多的中期分裂相,且染色體形態(tài)良好。在此濃度下設(shè)計(jì)3個(gè)作用時(shí)間梯度,作用3 h時(shí)3個(gè)倍性的泥鰍鰭細(xì)胞正常染色體的眾數(shù)均為最高,一方面說明該濃度最適合泥鰍鰭細(xì)胞染色體制備的需要,另一方面,作用3 h時(shí)的正常染色體眾數(shù)高于或等于其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),也可成為采用3 h作為最優(yōu)條件的依據(jù)。另外,天然四倍體泥鰍鰭細(xì)胞在秋水仙素作用2 h和3 h時(shí),正常染色體的眾數(shù)相等,均為70.00%,可能是由于每個(gè)處理組處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞存在較小的誤差造成的。

3.2.2 低滲時(shí)間對(duì)染色體的影響 低滲處理時(shí)間對(duì)染色體制備也有影響。如果低滲過度,易使細(xì)胞核膨大過度,容易過早被打破,造成染色體數(shù)目丟失;反之,細(xì)胞核膨脹不足或不膨脹,核中的染色體不容易散開,不易獲得效果良好的染色體分裂相。本試驗(yàn)結(jié)果表明,泥鰍鰭細(xì)胞染色體制備時(shí)低滲時(shí)間以40 min為宜。雖然50 min低滲處理組染色體交叉數(shù)≤3的眾數(shù)普遍大于30 min和40 min處理組,但是染色體過于分散,數(shù)目丟失,因此不可取。雜交三倍體泥鰍鰭細(xì)胞的3個(gè)處理組染色體交叉數(shù)≤3的眾數(shù)相等,也可能是由于每個(gè)處理組處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞存在較小的誤差造成的。從染色體形態(tài)來看,30 min低滲處理組染色體相對(duì)集中,臨近染色體區(qū)分不易;50 min低滲處理組染色體相對(duì)分散,但個(gè)別有丟失現(xiàn)象,故低滲時(shí)間仍然以40 min為宜。據(jù)報(bào)道,魚類染色體制備的低滲時(shí)間一般在30 min左右,不同魚種的低滲時(shí)間相差不大,鯉為35 min[31],羅非魚和花鱸均為30 min[3,32]。

除了上述討論的幾個(gè)因素以外,細(xì)胞生長周期的選擇也是影響染色體制備的因素。一般選擇處于生長對(duì)數(shù)期的細(xì)胞作為制備染色體的材料,這是由于該時(shí)期的細(xì)胞生長活力好、分裂旺盛,有利于秋水仙素以及低滲液的作用。另外,采用預(yù)固定的方式也有助于獲得良好的中期分裂相。一般做法是在低滲結(jié)束前5～10 min加入10滴固定液,有助于分散細(xì)胞,不易結(jié)團(tuán)。如果固定的時(shí)間不夠,過早打散或吹打過于激烈都可能造成染色體丟失[4]。此外,滴片的高度也會(huì)影響染色體分散效果,一般以30 cm為宜。

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The cell culture of fin tissue and preparation of chromosomes in different ploid loach Misgurnus anguillicaudatus

LIU Bo,LI Ya-juan,LI Xia,SUI Yi,GAO Yang-chun,WANG Yu-sheng,MA Chen
(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The effects of disinfection methods,concentrations(1.0,1.5,and 2.0 μg/mL)of colchicine,processing time(2,3,and 4 h)of colchicine and hypotonic treatment(30,40,and 50 min)on short-term cell culture of fins and the condition for chromosome preparation were studied in natural diploid,hybrid triploid(4n♀×2n♂) and natural tetraploid loach Misgurnus anguillicaudatus.Results showed that the best disinfection was observed at 100 g/L lodophor with little influence on cell growth,especially rapid cell movement at processing time of 15 min. The maximal chromosome mode was frequencies of normal metaphase spread of natural diploid(93.33%),hybrid triploid(90.00%)and natural tetraploid(70.00%)when the colchicine was added 3 h before the termination of cell culture until to final concentration of 1.5 μg/mL.The clear metaphase spreads with moderate length,excellent dispersion and complete number was observed under condition of hypotonic treatment at below 25℃ for 40 min.In summary,the chromosome preparation method was preliminarily established using cell culture of fins in loach.

Misgurnus anguillicaudatus;natural tetraploid;hybrid triploid;diploid;fin tissue;chromosome

S966.4

A

2013-08-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31272650);遼寧省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(201102019);大連海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(017208)

劉博(1988-),女,碩士研究生。E-mail:xiaowen8901@126.cn

李雅娟(1961-),女,教授。E-mail:liyajuan@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)06-0557-06