六種貓科動物線粒體基因組比較

魏 磊，柳建國，劉 芳，諸立新

線粒體基因組（mitochondrial genome，mtDNA）是核外遺傳物質(zhì)，具有分子小、結(jié)構(gòu)緊湊、演化快速、種間差異大、種群內(nèi)穩(wěn)定性高、母系遺傳及無重組等特性［1－3］。近年來，線粒體全基因組序列比較分析作為一種基因進(jìn)化的模式已被廣泛地應(yīng)用于分子動力學(xué)、比較遺傳學(xué)、物種進(jìn)化和系統(tǒng)關(guān)系的研究［4］。

貓科動物的線粒體是一種雙鏈DNA分子，含有13個(gè)左右的蛋白編碼基因、2個(gè)rRNA和22個(gè)tRNA基因。在線粒體基因組所編碼的37個(gè)基因中，NADH 2、NADH 4、12／16SrRNA、Cyt b和D－loop區(qū)等材料相繼被用于貓科動物的系統(tǒng)學(xué)研究［5－6］。全球現(xiàn)存37種動物貓科動物（Felidae），而線粒體全序列測序的物種較少，因而補(bǔ)充該類群線粒體全序列有利于正確地解決其存在的系統(tǒng)發(fā)育問題。本文測定了豹（Panthera pardus）、虎（Panthera tigris）和雪豹（Panthera uncia）線粒體基因組全序列，并與貓（Felis catus）、獵豹（Acinonyx jubatus）和云豹（Neofelis nebulosa）線粒體基因組全序列進(jìn)行比較分析，為貓科動物線粒體譜系基因組學(xué)的研究提供新的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 線粒體DNA提取和擴(kuò)增

用線粒體萃取試劑盒（GENMED Scientifics Inc.，USA）抽提與萃取線粒體DNA。根據(jù)Gen－Bank已公布的家貓、獵豹和云豹線粒體基因組全序列及虎的部分線粒體基因組序列，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)出34對引物。PCR反應(yīng)都在PTC－200型DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體系為30μL，其中含有10mmol Tris－HCl（pH 8.3），50mmol KCl，1.5mmol MgCl2，100μmol dNTPs，引物各0.25μmol，1UTaq DNA 聚合酶，總DNA約25ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性45s，52～60℃復(fù)性50s，72℃延伸50s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。循環(huán)前95℃預(yù)變性5min，循環(huán)后繼續(xù)延伸7min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖電泳檢測。

1.2 測序及序列分析

擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。測序得到的序列通過DNASTAR（2001）、Clustal X（1.8）和測序峰圖結(jié)果分析軟件 Chromas 2.22分析，經(jīng)人工校正、BLAST 比對后拼接，最后得到豹、虎和雪豹線粒體控制區(qū)的全部序列，GenBank序列檢索號分別EF551002、EF551003和EF551004。從GenBank獲取貓（NC－001700）、獵 豹 （AY463959）和 云 豹（DQ257669）線粒體全序列［7－9］，用 ClustalX 軟件對貓、獵豹、豹、虎、雪豹和云豹線粒體全序列進(jìn)行比對，用 MEGA 3.0統(tǒng)計(jì)線粒體基因組堿基組成，蛋白質(zhì)基因密碼子使用頻率，使用DNAsis模擬tRNA的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 線粒體基因組組成與排列

貓、獵豹、豹、虎、雪豹和云豹線粒體全序列全長分別為17009 、17011、16964、16990、16773和16844bp。線粒體基因組與其它脊椎動物相似，由13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)tRNA，2個(gè)rRNA、一個(gè)非編碼的控制區(qū) （D－loop）和一個(gè)輕鏈復(fù)制起點(diǎn)（OLR）所組成。除 NADH6和tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer（UCN）、tRNAGlu、tRNAPro在 L－鏈（light strand）上編碼之外，其余基因均在 H－鏈（heavy strand）編碼?；蚺帕芯o密，每個(gè)物種的線粒體基因存在8～10處的基因重疊，其中重疊堿基較多的是ATPase 8和ATPase 6基因，重疊范圍在41～43bp；基因間隔8～11處，大小在1～25bp之間，基因間隔最大的是在雪豹線粒體COIII～tRNAGly之間，間隔長度為25bp。

2.2 線粒體核苷酸組成

6種貓科動物線粒體基因組的整個(gè)堿基組成中，堿基含量的大小排列是A＞T＞C＞G。A－T含量比G－C含量高，而且AT偏斜也比GC偏斜高。13種蛋白質(zhì)編碼基因、22種tRNA基因、2種rRNA基因和D－loop區(qū)的詳細(xì)的堿基組成分析被列于表1中。在蛋白質(zhì)編碼基因第一密碼子中，豹和貓 A的含量偏低，分別為22.5%和27.3%，略低于整個(gè)線粒體基因組A的平均含量（31.8%）；貓、獵豹、云豹、虎和雪豹的含量遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量；在蛋白質(zhì)編碼基因第二密碼子中，豹T的含量偏低，分別為22.6%，而貓、虎、雪豹、獵豹和云豹T的含量分別為32.0%、40.4%、40.1%、38.7%和41.6%，表現(xiàn)出對T的偏好；特殊的是在第二密碼子中，只有豹G的含量低，為8.1%，其它的則基本一致；第三密碼子在堿基使用上也出現(xiàn)較大的差異，云豹和豹G的含量較高，分別為25.1%和19.2%，高于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量，而其它4個(gè)物種G的含量則低于整個(gè)基因組G的含量（表1）。

表1 6種貓科動物線粒體基因組不同部分的核苷酸組成

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因

2.3.1 蛋白質(zhì)編碼基因密碼子使用

在6種貓科動物mtDNA的蛋白質(zhì)編碼基因中，NADH1、NADH4L、ND4、COI、COII、ATP6、ATP8和Cytb的起始密碼子為 ATG，云豹的ND6的起始密碼子也是ATG；雪豹的COIII是以ATA為起始密碼子的。NADH3和NADH5的起始密碼子為ATA；貓、豹、虎和雪豹ND2的起始密碼子為ATC，而云豹和獵豹ND2的起始密碼子為ATT；豹、虎、雪豹、貓和獵豹的Cyt b起始密碼子為ATG，只有云豹Cyt b基因較例外，起始密碼子為ATA。在終止密碼子 的 使 用 上，ND4L、ND5、ND6、COI、COII、ATP6和ATP8都以TAA為終止密碼子；除獵豹的ND1以TA終止，其它五個(gè)物種的ND1也是以TAA為終止密碼子的。六種貓科動物ND2和ND4都以單一密碼子T為終止密碼子，ND3都以TA為終止密碼子；雪豹的COIII基因較為特殊，以TAA終止，其它五個(gè)物種的COIII基因是以T終止的（表2）。6種貓科動物的13種蛋白編碼基因的密碼子使用和氨基酸分布模式大多數(shù)是相類似的。只在UUC、UUU、CUC、AUC、AUU、UCU、CCG、ACA、UAA、UAG這些密碼子的使用上有明顯的區(qū)，豹和貓使用CUC分別為35和57次，約為其它四個(gè)物種的三分之一到二分之一；豹使用UCU、UAA和UAG分別為113、106和151次，顯著的高于其它五個(gè)物種（表3）。

表2 6種貓科動物13種蛋白編碼基因起始／終止密碼子使用比較

表3 6種貓科動物13個(gè)線粒體蛋白編碼基因的密碼子使用

續(xù)表

2.3.2 基因的編碼方式及遺傳密碼

所有22個(gè)tRNA基因及其反密碼子都在6種貓科物種中發(fā)現(xiàn)，基因的編碼方式與核基因不同，基因的起始和終止采用極為壓縮的方式進(jìn)行連接，有時(shí)甚至重疊好幾個(gè)堿基。遺傳密碼系統(tǒng)與核基因的標(biāo)準(zhǔn)密碼有些不同，在這些遺傳編碼中，TAG編碼色氨酸（Trp）而不是終止密碼子；密碼子ATA編碼了甲硫氨酸（Met）而不是異亮氨酸（Ile）；AGA作為終止密碼子再現(xiàn)，而不是編碼精氨酸（Arg），這些都不同于核基因組中的密碼子利用。

2.4 rRNA 基因

虎、豹、雪豹、云豹、獵豹和貓線粒體12SrRNA基因位于tRNAPhe和tRNAVal之間，核苷酸序列總長度分 別 為 960、959、960、958 960 和 960bp；16S rRNA位于tRNAVal和tRNALeu（UUR）之間，核苷酸序列總長度分別為1575、1572、1580、1573、1572和1574bp。統(tǒng)計(jì)分析顯示，盡管序列的堿基組成呈現(xiàn)A－T的偏異，但A與G的含量遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組A和G的平均含量。

2.5 tRNA基因

虎、豹、雪豹、云豹、獵豹和貓線粒體基因組都有22個(gè)tRNA，長度在58～77bp之間，最長的是tRNALeu（UUR））基 因，最 短 的 是tRNASer（AGY）基 因。預(yù)測的tRNA二級結(jié)構(gòu)顯示，除tRNASer（AGY）與其它脊椎動物一樣為二葉草結(jié)構(gòu)，缺失了“DHU”臂［10，11］以外，其余均為典型的三葉草結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)包括6～8bp的氨基酸接受臂，2～5bp的TΨC臂，5～7bp的反密碼子臂，4～6bp的二氫尿嘧啶臂 （DHU臂）。tRNA折疊除了有正常的堿基配對外，還有G＋T配對（圖1）。在形成三葉草狀二級結(jié)構(gòu)的tRNA中，tRNASer（AGY）的“DHU”臂缺失現(xiàn)象較為普遍，脊椎動物在tRNASer（AGY）上都缺失“DHU”臂［12］；而且在有袋類動物北美負(fù)鼠（Didelphisvirginiana）的tRNALys基因上也表現(xiàn)出“DHU”臂的缺失［13］。

圖1 線粒體基因組tRNA的二級結(jié)構(gòu)示意圖（以豹為例）

2.6 非編碼區(qū)

虎、豹、雪豹、貓、獵豹和云豹的輕鏈復(fù)制起始（OLR）都是位于tRNAAsn和tRNACys之間，長度在32～39bp間，并不一致。OLR區(qū)域可以折疊成一個(gè)熱力學(xué)上穩(wěn)定的莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，莖由11個(gè)核苷酸對組成，環(huán)由14個(gè)核苷酸組成，組成環(huán)的核苷酸在重鏈上以Poly（T）為主。涉及由RNA合成轉(zhuǎn)變成DNA合成的特殊片段5’－GCCGG－3’［14］，在貓、獵豹、云豹、虎、豹和雪豹是完全保守的，與人的一致。OLR的莖長度完全相同，其中貓、獵豹、云豹和雪豹享用tRNACys基因的4個(gè)堿基，其在基部的11對核苷酸序列與其他脊椎動物線粒體基因組一樣是高度保守的，而環(huán)的序列變異較大（圖2）。

圖2 6種貓科動物線粒體基因輕鏈復(fù)制起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)。圖中為重鏈序列；方框的序列表示RNA合成到DNA的合成的轉(zhuǎn)變.

6種貓科動物mtDNA的控制區(qū)位置在tRNAPro和tRNAPhe之間，長度略有變化，但與哺乳動物的D－loop區(qū)長度相似，都在1.5kb左右?？刂茀^(qū)在結(jié)構(gòu)組成上是線粒體基因組中變化最大的區(qū)域。參考Kim等［15］的研究結(jié)果，預(yù)測了6種貓科動物線粒體控制區(qū)（D－loop）的結(jié)構(gòu)，包括左域（Leftdomain）、中間保守區(qū)（conserved sequenceblocks，CSB）以及右域（Rightdomain）的位置，確定了高變區(qū)（HVS）、重復(fù)序列區(qū)（RS）。在6種貓科動物的D－loop區(qū)內(nèi)存在一些微衛(wèi)星序列和重復(fù)序列（表4）。

表4 6種貓科動物線粒體基因組控制區(qū)的比較

3 討論

3.1 貓科動物mtDNA堿基的組成特點(diǎn)

貓科動物線粒體全基因組包括13個(gè)蛋白編碼基因，22個(gè)tRNA基因，2個(gè)rRNA基因和一個(gè)控制區(qū) （D－loop）。與其他的脊椎動物的mtDNA一樣，大多數(shù)基因在重鏈（H鏈）編碼，只有ND6和8個(gè)tRNA基因在輕鏈（L鏈）編碼。堿基含量的大小排列是A＞T＞C＞G，A－T含量比G－C含量高，而且AT偏斜比GC偏斜高。

3.2 蛋白質(zhì)編碼基因

貓科動物線粒體基因組共有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，除ND6基因由L鏈編碼外，其余的均由H鏈編碼，沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子，有些基因與其他基因存在少許重疊。在起始密碼子的使用上和大多數(shù)脊椎動物線粒體編碼基因常用的起始密碼子是同源的［16］。在大多數(shù)的脊椎動物中，COI基因是以GTG為起始密碼子的，而Boore等［17］認(rèn)為COI基因起始端只有GTG，沒有其它的起始形式?；趯ω埧苿游飉tDNA的研究和以前的結(jié)果，說明COI基因起始密碼子除GTG外，還有ATG［18，19］。據(jù)目前不完全統(tǒng)計(jì)，脊椎動物 mtDNA編碼基因的起始密碼子種類有ATG、GTG、ATA、ATC、ATT和 ACA，在使用頻率上，ATG約占95%以上。在終止密碼子的使用上也與大多數(shù)哺乳動物的終止密碼子使用情況類似［20］。一些研究認(rèn)為，不完全終止密碼子（T或TA）是由轉(zhuǎn)錄后的 mRNA3’端的PolyA補(bǔ)齊［21］，因而貓科動物線粒體基因組中的不完全終止密碼子T或TA應(yīng)補(bǔ)齊為TAA。終止密碼子AGA在六種貓科動物的Cyt b基因中出現(xiàn)，這種終止方式也分別在人和牛的 COI和 Cyt b基因中出現(xiàn)［10，22］；此結(jié)果說明哺乳動物線粒體Cyt b基因的終止密碼子傾向使用AGA，有別于其它類群。

通常認(rèn)為，哺乳動物線粒體蛋白質(zhì)編碼基因密碼子的第三位點(diǎn)AT偏向性尤其明顯，在6中貓科動物中，豹在第一位點(diǎn)上表現(xiàn)出比其他5種動物更加明顯的AT偏向性，這種現(xiàn)象在其它物種中是較少為見的。尤其是第二位密碼子的堿基含量波動較大，A和C遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組A和C的平均含量，而G的含量遠(yuǎn)低于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量。第三密碼子在堿基使用上也出現(xiàn)較大的差異，G的含量遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量。該結(jié)果表明線粒體基因組中堿基變化主要由密碼子第二、三位堿基變化造成。

3.3 rRNA和tRNA基因

以貓線粒體基因組中的12／16SrRNA基因的核苷酸序列作對比序列，結(jié)果顯示，虎與貓相比有119堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換、19堿基位點(diǎn)顛換；豹與貓相比有119堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換，25堿基位點(diǎn)顛換；雪豹與貓相比有113堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換，26堿基位點(diǎn)顛換；云豹與貓相比有112堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換，24堿基位點(diǎn)顛換；獵豹和貓相比126堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換，21堿基位點(diǎn)顛換。分析結(jié)果顯示，虎與雪豹、豹的2個(gè)rRNA基因的同源性最高，分別為95%和94.7%，與貓的同源性次之，為93.6%；與云豹的同源性較低為93.4%，與獵豹的同源性最低為93.2%。說明12／16SrRNA基因有較高的保守性。

在tRNAAsn和tRNACys之間存在相當(dāng)于輕鏈復(fù)制起始的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，tRNA序列變異主要發(fā)生在環(huán)區(qū)，莖區(qū)相對保守。其中一些變異如雙鏈的互補(bǔ)性堿基突變、G－T配對等在所預(yù)測的貓科動物tRNA二級結(jié)構(gòu)中都有出現(xiàn)，大部分堿基對符合Wasten－Click配對原則，另有一些GT變偶堿基對符合G－T擺動配對原則，這對于維系tRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到非常重要的作用。一些學(xué)者認(rèn)為線粒體基因組tRNA基因的部分錯配可以通過RNA自我剪切來恢復(fù)基因的功能，不會引起氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)上的障礙［23］。關(guān)于tRNASer（AGN）基因缺少DHU臂，這種情況在脊椎動物線粒體中比較常見。tRNASer（AGN）基因均缺少DHU臂的長度由低等無脊椎動物到高等脊椎動物逐漸變短。對哺乳動物這類tRNA的研究表明，它們可以形成潛在的L型結(jié)構(gòu)以維持反密碼子與CCA接受臂之間的距離［24］，tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)特定氨基酸的功能及其L形的三級結(jié)構(gòu)主要由氨基酸臂和反密碼子環(huán)決定，而TΨC環(huán)和DHU環(huán)，及其相應(yīng)的臂，似乎不會抑制tRNA 的功能［25，26］。

3.4 控制區(qū)

6種貓科動物的D－loop區(qū)的長度略有變化，但與哺乳動物的D－loop區(qū)長度相似，都在1.5 kb左右，但與某些脊椎動物，如兩棲類無尾目的澤蛙、黑斑蛙和非洲爪蟾的D－loop區(qū)差別較大（2kb以上）。從表4可看出6種貓科動物的D－loop區(qū)的長度并不一致。其原因主要出現(xiàn)在HVS－1、HVS－2和RS－3區(qū)域的變化上：在HVS－1區(qū)，貓和獵豹的序列較長，而虎、雪豹、豹和云豹的序列則較短，分別比貓少66、119、133和189bp，比獵豹少94、138、145和200bp；在RS－3和HVS－2區(qū)，虎、豹和云豹的序列較長，而貓、獵豹和雪豹的序列則較短，分別短66～149bp。6種動物在D－loop區(qū)都有許多串聯(lián)重復(fù)單元，但拷貝數(shù)及每一重復(fù)單元的長度并不一樣，但6種動物的重復(fù)序列間有著較高的相似性（表4）。這表明它們可能有著共同的起源。關(guān)于重復(fù)序列的生物學(xué)功能有兩個(gè)主要的觀點(diǎn)：一種觀點(diǎn)認(rèn)為，重復(fù)序列可能在線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中起到一定的 調(diào) 控 作 用［27，28］；然 而 Casane 等［29］認(rèn) 為不具有生物學(xué)功能，是一些冗余序列。這兩種觀點(diǎn)還有待于進(jìn)一步的探討。至于重復(fù)序列產(chǎn)生的機(jī)制，目前認(rèn)為是由于鏈的滑動錯配所導(dǎo)致［30，31］。另外，貓、獵豹、云豹、虎、豹、雪豹線粒體控制區(qū)的CSB—1、CSB—2區(qū)堿基序列與完全一致。在CSB—3區(qū)，豹、雪豹完全相同，虎與之有一個(gè)堿基的差異（堿基G）；云豹與家貓、獵豹相比存在4個(gè)堿基的差異，云豹在此區(qū)域存在4個(gè)堿基變異的現(xiàn)象，在貓科物種中極為少見，因此，這三個(gè)區(qū)域的生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步探討。

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