清熱解毒中藥對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷影響的實(shí)驗(yàn)研究

朱祖成

湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000

心肌缺血，是冠心病的一種重要病理環(huán)節(jié)［1］。目前，國內(nèi)外學(xué)者多認(rèn)為炎癥細(xì)胞浸潤、脂質(zhì)過氧化損傷、冠脈內(nèi)皮功能障礙、血管平滑肌遷移與增殖、血小板聚集等因素都是冠心病炎癥反應(yīng)的始動因素，炎癥貫穿了冠心病發(fā)生發(fā)展的全過程［2－3］。

清熱解毒中藥不僅具有清熱解毒的功效，同時(shí)還具有療虛、通絡(luò)等功效;并且現(xiàn)代藥理研究表明［4－5］，清熱解毒中藥大多具有抗炎作用，能抑制炎癥介質(zhì)的合成和釋放，具有抗脂質(zhì)過氧化損傷及抗血管平滑肌增殖的作用。清熱解毒中藥可通過降血脂、拮抗內(nèi)皮素、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和抑制血小板聚集以達(dá)到抗炎的目的。

本文選擇臨床常用的清熱解毒類中藥黃連、穿心蓮、梔子3味中藥，進(jìn)行中藥對體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血再灌注樣損傷影響的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，以找出清熱解毒中藥干預(yù)冠心病心肌缺血的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SD大鼠，SPF級，雄性，體重:250～300g，150只，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供(SCXK(京)2006－0008)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 黃連、穿心蓮、梔子的提取物 (鄭州穎河生物科技有限公司);鹽酸地爾硫卓片 (天津田邊制藥有限公司);LDH、SOD、MDA、NO、NOS、IL－6、TNF－α試劑盒 (中生北控生物科技股份有限公司);DMEM干粉、胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ、胎牛血清 (Hyclone);MTT、DMSO(美國Sigma)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 中藥含藥血清的制備［6］中藥含藥血清按通法制備:健康SD大鼠，每天灌胃給藥2次，早晚各1次，(即一天的劑量分2次服用)，連續(xù)3d(第4 d一次服用全天劑量)，末次給藥后1h戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，不抗凝，室溫靜置30min;待凝血堅(jiān)固、血清析出后室溫、3000rpm，離心10min，上清液即為含藥血清。同組含藥血清混合均勻，56℃、水浴滅活30min，0.22μm微孔濾膜過濾、除菌，EP管分裝，－20℃低溫冰箱中凍存，備用。

1.3.2 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)［7］1～3日齡的大鼠乳鼠，無菌條件下脫頸椎處死，取心尖部組織，將其剪成約1mm3大小碎塊，適量0.125%胰酶及0.05%Ⅱ型膠原酶消化，37℃恒溫水浴振蕩器中消化1 h(0.5 h時(shí)取出吹打一次)，20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，200目孔徑不銹鋼網(wǎng)篩過濾，細(xì)胞懸液900rpm·min－1，離心10 min，棄上清消化液PBS緩沖液沖洗細(xì)胞沉淀，連續(xù)3次;20%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100萬U雙抗 (青鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁分離1.5 h，得到純化的心肌細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度6×105個·m l－1，接種于鋪有1%明膠的培養(yǎng)板中。放入5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48h后換液。培養(yǎng)3d后選擇生長良好，搏動規(guī)律的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的復(fù)制［8］及分組 本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中含藥血清加入濃度為10%(體積分?jǐn)?shù))濃度的中藥含藥血清。本實(shí)驗(yàn)設(shè)6個實(shí)驗(yàn)組:即正常對照組、模型組、鹽酸地爾硫卓組、黃連組、穿心蓮組、梔子組。

正常對照組:取培養(yǎng)于6孔板的心肌細(xì)胞，洗棄舊培養(yǎng)基，換成含1%葡萄糖的D－h(huán)anks臺式液 (D－h(huán)anks液(g/L):NaCl 8.0，KCl 0.4，NaHPO4·H2O 0.06，KH2PO40.06，NaHCO30.35，酚紅 0.02)，1ml/孔，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h后取出換為含10%SD大鼠空白血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h。

模型組:洗棄舊培養(yǎng)基，換成氮?dú)?(N2)飽和的無糖D－h(huán)anks液 (500μl/孔)，置自制密閉盒中持續(xù)通以95%N2+5%CO2混合氣30min，充分排凈盒中殘余的氧氣，放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h后，取出換為含10%空白血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h，作復(fù)氧處理。

給藥組:洗棄舊培養(yǎng)基，每孔加入相應(yīng)體積 (即50μl)SD大鼠的不同中藥血清，N2飽和的無糖D－h(huán)anks液補(bǔ)足體積 (500μl)，使整個體系的中藥含藥血清濃度為10%(體積分?jǐn)?shù))，置自制密閉盒中持續(xù)通以95%N2+5%CO2混合氣30min，充分排凈盒中殘余的氧氣，放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h，作缺氧處理，吸棄細(xì)胞上清液。再加入相應(yīng)體積 (即50μl)SD大鼠的不同中藥血清，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)足體積 (500μl)，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，作復(fù)氧處理，取細(xì)胞上清液，測定各生化指標(biāo)的含量或活力。

1.3.4 MTT法檢測心肌細(xì)胞相對活力 另取生長于96孔板上的心肌細(xì)胞，板周邊的孔不加細(xì)胞，防止有邊緣效應(yīng)。PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，(留空白孔調(diào)零，以只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞作空白對照)分別加入10%(體積分?jǐn)?shù))濃度空白血清或不同藥物血清的DMEM培養(yǎng)基100μl。每組設(shè)8個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，PBS沖洗2次，加入MTT 100μl/孔 (PBS配制，0.22μm濾器過濾除菌)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h，棄MTT液，每孔加入200μl純DMSO裂解細(xì)胞，震蕩10min使MTT藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，用RT－6000酶標(biāo)儀于490nm波長處測定各孔吸光度 (OD)值。每孔OD值減去空白孔OD值為測試孔OD真實(shí)值，活細(xì)胞數(shù)與OD值成正比。

1.3.5 上清液中細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷觀察指標(biāo)的檢測 取缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，按照TNF－α、IL－6 ELISA試劑盒說明書要求操作，使用Rayto酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)液中TNF－α、IL－6水平;按照NO、NOS、SOD、MDA試劑盒說明書要求操作，使用半自動生化分析儀，分別測定培養(yǎng)液中SOD、NOS活力，MDA、NOS含量;按照LDH試劑盒說明書要求操作，使用半自動生化分析儀，測定培養(yǎng)液中LDH活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作One－Way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 清熱解毒中藥血清對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞LDH、SOD、MDA釋放量的影響 與正常對照組比較，缺氧復(fù)氧模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA釋放量顯著升高，SOD活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);與模型組比較，黃連、穿心蓮組培養(yǎng)液中LDH、MDA釋放量顯著降低，SOD活性升高 (P＜0.01或P＜0.05)，梔子組培養(yǎng)液中LDH釋放量降低 (P＜0.01)。結(jié)果見表1。

表1 清熱解毒中藥血清對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH、SOD和MDA釋放量影響 (n=5，±s)

表1 清熱解毒中藥血清對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH、SOD和MDA釋放量影響 (n=5，±s)

注:與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

組別 劑量/mg·kg－1·d－1 LDH 活力/U·L－1 SOD 活力/U·ml－1 MDA含量/nmol·ml －1 102.46±3.51 85.67±5.29 3.46±0.34模型組 － 434.23±27.75△△ 56.84±5.44△△ 6.48±0.53△△鹽酸地爾硫卓組 37.8 332.58±27.28△△※※ 67.25±4.25△△※※ 5.61±0.65△△※※黃連組 122.54 388.71±32.51△△※※ 68.82±4.49△△※※ 5.72±0.48△△※※穿心蓮組 191.84 407.42±20.85△△※ 67.08±4.71△△※※ 5.87±0.46△△※梔子組 559.44 386.01±21.60△△※※正常對照組 －57.85±4.24 6.37±0.48

2.2 清熱解毒中藥血清對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞TNF－α、IL－6釋放水平的影響 與正常對照組比較，缺氧復(fù)氧模型細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF－α、IL－6水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);與模型組比較，黃連、穿心蓮組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF－α、IL－6水平顯著降低，梔子組培養(yǎng)液中IL－6水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05或 P＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 清熱解毒中藥血清對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞TNF－α、IL－6釋放水平影響 (n=5，s)

表2 清熱解毒中藥血清對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞TNF－α、IL－6釋放水平影響 (n=5，s)

注:與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

組別 劑量/mg·kg－1·d－1 TNF － α/pg·ml－1 IL －6/pg·ml －1 257.55±13.63 85.91±7.30模型組 － 708.00±44.49△△ 178.99±7.73△△鹽酸地爾硫卓組 37.8 682.36±35.62 175.58±7.88黃連組 122.54 565.54±33.13△△※※ 134.99±16.22△△※※穿心蓮組 191.84 586.41±31.10△△※※ 161.54±3.64△△※※梔子組 559.44 690.41±44.10 169.04±6.70正常對照組 －△△※

2.3 清熱解毒中藥血清對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞NO、NOS釋放水平的影響 與正常對照組比較，缺氧復(fù)氧模型細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量、NOS活力顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);與模型組比較，黃連、穿心蓮組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量顯著降低，黃連組細(xì)胞培養(yǎng)液中NOS活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01或P＜0.05)。結(jié)果見圖1、2。

3 討論

正常情況下，TNF－α在心肌細(xì)胞中沒有表達(dá)，但當(dāng)外環(huán)境發(fā)生改變時(shí)也可分泌TNF－α，并與自身的TNF－α受體結(jié)合產(chǎn)生有害的生物學(xué)效應(yīng)［9］。結(jié)果提示，心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷培養(yǎng)液中炎癥因子TNF－α、IL－6水平均顯著性升高;黃連、穿心蓮能顯著抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞分泌炎性因子TNF－α、IL－6，梔子能顯著抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞分泌炎性因子IL－6，對心肌細(xì)胞具有防護(hù)作用。

NO和NOS在心肌缺血再灌注損傷 (MIRI)中起著極其重要的作用。產(chǎn)生于心肌細(xì)胞的誘生型iNOS催化分泌NO立即與氧反應(yīng)生成氧自由基，并且NO亦可直接作用于心肌細(xì)胞，可認(rèn)為是一種自分泌方式，對心肌具有毒性作用［10］。結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量與NOS活力更加急劇升高，進(jìn)一步加深心肌細(xì)胞的氧化損傷。黃連、穿心蓮能顯著減弱NOS活力，減少NO的形成釋放，保護(hù)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞。

研究顯示［11－12］，心肌缺血－再灌注后很短時(shí)間內(nèi)，心肌組織內(nèi)氧自由基爆發(fā)式產(chǎn)生，與心肌細(xì)胞膜上的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生連鎖反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞 (器)膜流動性顯著降低，通透性顯著升高，蛋白功能異常，線粒體腫脹乃至崩解以及DNA斷裂等，最終細(xì)胞出現(xiàn)壞死或凋亡，進(jìn)一步加深缺血心肌不可逆損傷。結(jié)果顯示，清熱解毒中藥能改善缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞中LDH的漏出率，提高SOD活力，減少M(fèi)DA含量。

本實(shí)驗(yàn)通過血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的運(yùn)用，可以得出結(jié)果，清熱解毒中藥通過降低缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞分泌炎性因子TNF－α、IL－6;降低NO對心肌細(xì)胞的毒性作用，升高SOD活力，抑制脂質(zhì)過氧化損傷，降低LDH活性等作用保護(hù)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞。

［1］ BeckerL B．New concepts in reactive oxygen species and cardiovascular reperfusion physiology ［J］．Cardiovasc Res，2004;61(3):461 －473．

［2］陳冰雪，劉莉，鮑軍強(qiáng)，等．細(xì)胞因子對冠心病發(fā)生、發(fā)展的作用及影響［J］．白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，12;7(6):376－377．

［3］張賽男，黃萍，鄔左莉，等．清熱解毒治療冠心病機(jī)理探討［J］．浙江中醫(yī)雜志，2007;42(4):194－195．

［4］沈自尹．清熱解毒藥對感染性炎癥作用原理的新認(rèn)識［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，10;17(10):628－629．

［5］范文昌，梅全喜，歐秀華，等．12種廣東地產(chǎn)清熱解毒藥材抗炎作用的研究［J］．中國藥材，2011，20(8)，28－29．

［6］韓林，賈波，石含秀，等．中藥血清藥理學(xué)研究探討與思考［J］．中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，19(5):319－321．

［7］伍長學(xué)，范英，李新，等．新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)［J］．瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32(1):1－4．

［8］Amer Talbi Yong jie Zhang Xijing Chen，etal．心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型研究與應(yīng)用進(jìn)展［J］．內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011，30(12):137－138．

［9］曾琳琳，張曉剛，胡波．高濃度葡萄糖對乳鼠心肌細(xì)胞腫瘤壞死因子－α基因表達(dá)的影響［J］．國際心血管雜志，2009，9;36(5):300－304．

［10］王超，常小榮．NO、NOS在心肌缺血再灌注損傷中的作用及中藥針灸治療的概況［J］．湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2002，12;8(12):738－741．

［11］ Chuan Yu Li，RobertM．Jackson．Reactive speciesmechanisms of cellular hypoxia reoxygenation injury ［J］．Am J Physiol Cell Ph，2002，282:C227－230．

［12］ Nandor，Marczin，Nihal El－ Habashi，Ginette S．Hoare，etal．Antioxidants in myocardial ischemia－reperfusion injury:therapeutic potential and basic mechanisms［J］．Arch Biochem Biophys，2003，420:222 －225．