Real-Time PCR法檢測TMPRSS4在肺癌中的表達及臨床意義

周 前 郭建極* 劉 濤 陳銘伍 冼 磊 胡 松

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科，廣西 南寧 530021）

Real-Time PCR法檢測TMPRSS4在肺癌中的表達及臨床意義

周 前 郭建極* 劉 濤 陳銘伍 冼 磊 胡 松

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科，廣西 南寧 530021）

目的 檢測TMPRSS4（Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶4）在臨床非小細胞肺癌（NSCLC）患者的癌組織及癌旁組織的表達及其與臨床病理特征的關系。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測60例NSCLC患者的癌組織、癌旁組織TMPRSS4 mRNA的表達，取21例患者正常肺組織做對照。分析TMPRSS4與NSCLC臨床病理特征的相關性。結果 NSCLC患者的癌組織中TMPRSS4 mRNA的表達為正常組織的17.33倍；在NSCLC患者中，其癌組織TMPRSS4 mRNA的表達明顯高于相應癌旁組織TMPRSS4 mRNA表達（P＜0.05）。NSCLC患者中TMPRSS4 mRNA表達與患者年齡、性別及組織學類型無關（P＞0.05），與腫瘤的臨床分期、分化程度相關（P＜0.05）。結論 NSCLC患者的癌組織中高表達TMPRSS4 mRNA與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，且其高表達TMPRSS4 mRNA與腫瘤的惡性程度相關。

NSCLC；TMPRSS4；Real-Time PCR

肺癌是人類發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其侵潤、轉移機制尚未完全明確，已有多種分子標志物被運用于肺癌的診斷、治療及預后評價[1,2]。TMPRSS4是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族（TTSPs）中的新成員。有研究顯示，TMPRSS在胰腺癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3,4,5,6]，其亞型 TMPRSS4 表達存在組織特異性[7]，TMPRSS4通過促進上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉變引起腫瘤細胞的侵潤和轉移[7,8]。本實驗通過實時熒光定量PCR檢測臨床NSCLC患者癌組織、癌旁組織及正常肺組織中TMPRSS4 mRNA的表達，探討其與臨床病理特征的關系，為進一步研究TMPRSS4基因與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料

60例標本取自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科2011年11月至2012年5月手術切除的NSCLC患者的組織標本，所有患者初治，經(jīng)病理確診為NSCLC，所取標本均經(jīng)過患者本人及醫(yī)院倫理管理委員會同意。其中，男性42例，女性18例，年齡平均59.6 歲；根據(jù)WHO標準分型：其中鱗癌29例，腺癌31例；低分化25例，中分化13例，高分化22例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟UICC2007年分期標準：0期2例；Ⅰ期16例，Ⅱ期31個，Ⅲ期11例。所有標本離體后30min內(nèi)置于液氮中，并轉移至-80℃冰箱中保存，備后續(xù)實驗用。

1.2 TMPRSS4 mRNA檢測

取凍存的標本組織各約50mg，加入裂解液裂解后使用總RNA提取試劑盒（天根公司）抽提組織總RNA，并用分光光度法測定其純度與濃度。應用天根公司逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測TMPRSS4 mRNA。TMPRSS4引物委托TaKaRa公司設計及合成：上游5'-GGATAACTGATGGCAGTAAATGTGG-3'，下游5'-TCAACGTCTCTGATCTTTGATTGTG-3'，擴增長度130bp。反應條件：95℃30s，95℃5s，60℃30s，72℃20s，共40個循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及結果分析

Real-time PCR原理是Ct與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關系。每例標本均重復3次，取平均Ct值，每次實驗均設陰性對照，以超純水代替cDNA。非小細胞肺癌癌組織△Ct值與癌旁組織的△Ct值相比得出△△Ct，計算目的基因的相對表達量Ratio值=2-△△Ct。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，將其進行行t檢驗，其結果P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 比較TMPRSS4基因和內(nèi)參基因的擴增效率

隨機選取cDNA樣品模板進行10至10000倍梯度稀釋，檢測TMPRSS4基因和內(nèi)參基因的實時熒光曲線，通過cDNA濃度梯度的log值對△Ct值作圖比較兩基因的擴增效率，所得直線斜率為0.04，說明目的基因TMPRSS4和內(nèi)參基因擴增效率相似，實驗結果可用2-△△Ct進行計算。

2.2 實時熒光定量PCR法檢測

各樣本的擴增曲線都已達到平臺期，溶解曲線未檢測到明顯二聚體及其他非特異性熒光信號。

2.3 實時熒光定量PCR檢測結果顯示非小細胞肺癌患者癌組織中TMPRSS4 mRNA的表達是正常組織的17.33倍，其差別具有顯著統(tǒng)計學意義（P=0.001），見表1。非小細胞肺癌患者癌組織中TMPRSS4 mRNA的表達與性別、年齡、組織學類型無關（P＞0.05），與臨床分期、分化程度相關（P＜0.05），見表2。

表1 比較NSCLC組織和正常組織TMPRSS4 mRNA表達

表2 TMPRSS4 mRNA的表達與NSCLC臨床病理特征關系

3 討 論

肺癌是人類發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其侵潤、轉移涉及的具體機制尚未完全明確?？缒そz氨酸蛋白酶是最早發(fā)現(xiàn)蛋白酶家族之一，其中，Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶是一類具有單跨膜結構域的絲氨酸蛋白酶，TMPRSS4也被稱為MT-SP4，定位于11q23.3，基因全長48565bp，共有13個外顯子，437個氨基酸，分子量為48000[9]。在TMPRSS4基因高表達的腫瘤組織中，細胞形態(tài)會出現(xiàn)改變，比如細胞膜的邊緣波動和板狀偽足形成[10]。目前的研究結果表明，腫瘤細胞表面過量的TMPRSS4基因的表達產(chǎn)生的蛋白酶可以降解細胞膜外基質(zhì)，使惡性腫瘤細胞向相鄰周圍組織侵潤[11]。已經(jīng)證實，上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉變（EMT）可促進腫瘤細胞的侵潤、遷移及轉移[2]，本實驗采用Real-Time PCR檢測臨床NSCLC患者癌組織和相應癌旁組織及肺部良性病變患者的的正常肺組織，結果顯示NSCLC患者癌組織中TMPRSS4 mRNA的表達是正常組織的17.33倍，NSCLC患者癌組織中TMPRSS4 mRNA的表達與性別、年齡及組織學類型無關，與臨床分期、分化程度相關。另外，和正常組織相比，腺癌和鱗癌中TMPRSS4基因水平明顯提高，其結果與Larzabal L[12]的報道一致。TMPRSS4基因在NSCLC中的高表達與其在胰腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌的表達情況一樣，預示著TMPRSS4mRNA在NSCLC的高表達與其他腫瘤類病變一樣，TMPRSS4基因高表達能促進非小細胞肺癌的發(fā)生與發(fā)展。

總之，本文通過檢測臨床NSCLC患者組織中TMPRSS4基因表達，首次發(fā)現(xiàn)TMPRSS4基因在NSCLC組織中的表達高于相應癌旁組織及正常肺組織，且與腫瘤的臨床分期、病理分級有著顯著地相關性，這提示著TMPRSS4基因的高表達與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的相關性。對于TMPRSS4的研究，目前雖未深入，但我們有足夠理由相信其能促進非小細胞肺癌的浸潤、擴散和轉移。同時，基因TMPRSS4的檢測可能成為臨床非小細胞肺癌的預測、判斷患者預后的一個重要方法，從而對非小細胞肺癌的臨床診斷治療有重要指導意義。

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R734.2

B

1671-8194（2013）28-0154-02

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