HPLC法測(cè)定“化腐生膚”滲濾液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量

趙 莉田 徽* 李崇進(jìn)阮期平譚承佳

（1 綿陽(yáng)師范學(xué)院 分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621000；2. 綿陽(yáng)市人民醫(yī)院，四川 綿陽(yáng) 621000）

HPLC法測(cè)定“化腐生膚”滲濾液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量

趙 莉1田 徽1* 李崇進(jìn)2阮期平1譚承佳1

（1 綿陽(yáng)師范學(xué)院 分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621000；2. 綿陽(yáng)市人民醫(yī)院，四川 綿陽(yáng) 621000）

目的 建立用高效液相色譜法測(cè)定“化腐生膚”滲濾液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量，為其制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法 色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-甲酸水（78∶22），流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm，柱溫30℃。結(jié)果 β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧在0.0276～0.1935mg/mL范圍內(nèi)線性良好（r=0.9998），平均回收率均在95%～105%，RSD為2.223%，“化腐生膚” 滲濾液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧含量為0.3866 mg/mL。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便靈敏，可用于“化腐生膚” 滲濾液的質(zhì)量控制。

高效液相色譜；化腐生膚；β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧

“化腐生膚方”是由紫草、生大黃、白芷、川芎、黃柏等藥材按一定的比例組成，具有“化腐生膚，排膿解毒，活血止痛”的功效，其在綿陽(yáng)市人民醫(yī)院已臨床應(yīng)用十余年，治愈了5000余例燒燙傷患者，治愈率達(dá)96%。課題組前期發(fā)現(xiàn)極性較低的石油醚部位及氯仿部位為“化腐生膚方”治療燒燙傷作用的有效部位[1]。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)“化腐生膚方”，建立其提取物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)β，β’-二甲基丙烯酰阿卡寧是君藥紫草的指標(biāo)性成分[2]，本實(shí)驗(yàn)建立了采用HPLC法測(cè)定“化腐生膚方”的滲濾液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧的方法，為其的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BP211D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KH-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材及試劑

紫草、黃芩、川芎、當(dāng)歸、生大黃、黃柏、白芷等中藥材購(gòu)于四川誠(chéng)隆藥業(yè)，經(jīng)鑒實(shí)均系中國(guó)藥典一部（2010年版）收載正品。β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111689-200501）；色譜乙腈（美國(guó)fisher公司）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備

按“化腐生膚方”比例取各藥材，粉碎后過(guò)2號(hào)藥典篩，用95%乙醇浸漬6h后，以5mL/min/kg的速度滲漉并收集10倍量滲漉液吸取滲漉液3mL，放于燒杯中，在60℃以下烘干，用乙腈定容至10mL，搖勻，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精確量稱(chēng)取β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧標(biāo)準(zhǔn)品13.800mg，置于50mL小燒杯中，加入分析乙腈溶解后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，定容至刻度，濃度為0.276mg/mL。

2.3 色譜條件

色譜柱為DIKMA公司Diamonsil C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈：甲酸水（78∶22）；檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10uL。理論板數(shù)按β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法專(zhuān)屬性考察

在上述色譜條件下，考察色譜峰分離度并比較陰性實(shí)驗(yàn)色譜圖。

2.4.2 線性關(guān)系的考察

精密吸取β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、7mL至10mL容量瓶中，定容至刻度線，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)與對(duì)照品進(jìn)樣濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精確吸取0.276mg/mL的β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧標(biāo)溶液，連續(xù)進(jìn)樣五次測(cè)定，計(jì)算精密度。

2.4.4 穩(wěn)定度實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，每隔2h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算穩(wěn)定度。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

圖2 樣品HPLC圖

圖3 陰性對(duì)照HPLC圖

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

平行制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算穩(wěn)定度。

2.4.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量樣品3mL，共3份，精密吸取β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品1mL、2mL、3mL，按供試品制備定容到10mL，制備9份溶液，進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定，計(jì)算回收率。

2.4 樣品溶液含量測(cè)定

取3批樣品，按以上方法測(cè)定滲濾液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法專(zhuān)屬性

在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品在17.886min時(shí)出峰，分離效果較好，見(jiàn)圖1～圖3。

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，由標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)求得直線回歸方程為：y=10314x-137.48（r=0.9998），表明β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧的濃度在0.0276～0.1935mg/mL范圍內(nèi)，與吸收峰面積具有良好的線性關(guān)系。

3.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，由結(jié)果可見(jiàn)該實(shí)驗(yàn)方法的精密性高。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.3 穩(wěn)定度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，由結(jié)果可見(jiàn)供試品溶液在8h內(nèi)較穩(wěn)定。

3.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，由結(jié)果可見(jiàn)該實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性結(jié)果良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.2.5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，由結(jié)果可見(jiàn)該實(shí)驗(yàn)的回收率結(jié)果良好。

3.3 樣品溶液含量測(cè)定

取3批樣品，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 樣品溶液含量試驗(yàn)結(jié)果

4 討 論

含量測(cè)定是中藥提取工藝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵內(nèi)容之一。對(duì)于復(fù)方制劑而言，應(yīng)根據(jù)處方的功能主治及所含成分選擇合適的測(cè)定指標(biāo)，盡量體現(xiàn)含量測(cè)定指標(biāo)與藥物安全性、有效性的關(guān)聯(lián)。盡管測(cè)定的成分僅占制劑的很小一部分，但只要指標(biāo)選擇恰當(dāng)，也是質(zhì)量控制的重要手段。

“化腐生膚方”根據(jù)臨床及有效部位篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選定滲漉法進(jìn)行提取。其滲漉法以乙醇為溶媒提取到的有效成分含量較高，有利于含量的測(cè)定。課題組前期曾考察過(guò)其滲漉工藝，因此本實(shí)驗(yàn)選用滲漉液作為含量測(cè)定的對(duì)象。

對(duì)于“化腐生膚方”，紫草為方中主要藥材，其性味苦寒，歸心包絡(luò)、肝經(jīng)，具有涼血活血、消炎止疼、解毒透疹之功，用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等癥的治療，能清熱燥濕，瀉火解毒。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有抗菌、抗炎、抗癌等作用。其功效可部分反映整個(gè)成方制劑的功效，且用量較大，能反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量，故選紫草作為含量測(cè)定的藥材。β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧是紫草的活性成分，所以該實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)其提取物里的β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧含量進(jìn)行測(cè)定。關(guān)于該成分的含量測(cè)定，文獻(xiàn)報(bào)道多采用高效液相法[3-5]，該法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，故以β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧作為本品提取工藝質(zhì)量控制的指標(biāo)成分之一，以便高效地來(lái)控制整個(gè)成方制劑的質(zhì)量。

總之，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果良好，建立的方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便靈敏，可用于“化腐生膚” 滲濾液的質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于“化腐生膚方”的中藥新藥奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

[1] 田徽,阮期平,李崇進(jìn),等.“化腐生膚方”抗實(shí)驗(yàn)性燒燙傷及抗炎鎮(zhèn)痛抑菌有效部位的藥理篩選[J].中藥材,2011,34(1):111-115.

[2] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)編.中國(guó)藥典(2010年版·一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:238-239.

[3] 潘秀琴,徐淑卿.紫草中有效成分提取方法的研究[J].醫(yī)藥世界, 2006,8(5):81-82.

[4] 趙華,游勇基.紫草藥材化學(xué)成分的測(cè)定[J].海峽藥學(xué),2007,19 (4):35-38.

[5] 楊秀芳.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選紫草的提取工藝[J].中成藥,2005,27(3): 351-353.

Determinating Content of β, β-dimethylacryl Alkannin in Leachate of Huafushengfu by HPLC

ZAHO Li1, TIAN Hui1, LI Chong-jin2, RUAN Qi-ping1, Tan Chen-jia1
(1 Key Laboratory for Molecular Biology and Biopharmaceutic, Mianyang Normal University, Mianyang 621000, China; 2 Mianyang People's Hospital, Mianyang 621000, China)

Objective To develop a RP-HPLC method to determinat the content of leachate β, β-dimethylacrylalkannin in Huafushengfu,and provide the basis for the development of quality standards. Methods The coulmn was Diamonsil C18(250 mm×4.6mm, 5μm);the mobile phase was acetonitrileformic acid(78∶22); the flow-rate was set at 1.0 mL/min;the detection wevelength was 275nm and column temperature was 30 ℃. Results β, β-dimethylacrylalkannin had good linearity in the range of 0.0276～0.1935mg/mL(r=0.9998).The average recovery was 95%～105%. The RSD was 2.223 %.The content of leachate β, β-dimethylacrylalkannin in " Huafushengfu was 0.3866 mg/mL. Conclusion This method is rapid,simple and sensitive,and it can be using as the quality control of Huafushengfu.

HPLC; Huafushengfu; β, β-dimethylacrylalkannin

R644

B

1671-8194（2013）28-0002-03

2009年綿陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（09S002-6）

*通訊作者：E-mail：tianhui1009@126.com