薄層熒光掃描法測定三黃片中鹽酸小檗堿的含量

李步良柯天英王伯濤*

（1 江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 223002；2 南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211816）

薄層熒光掃描法測定三黃片中鹽酸小檗堿的含量

李步良1柯天英2王伯濤2*

（1 江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 223002；2 南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211816）

目的 建立薄層熒光掃描法測定三黃片中鹽酸小檗堿的含量。方法 以鹽酸-乙醇（1∶100）為提取溶劑，按薄層色譜法用硅膠G預(yù)制薄層板，苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶15∶0.3）為展開劑，展距4 cm，掃描激發(fā)波長：366 nm。結(jié)果 鹽酸小檗堿在0.0173～0.1214 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y =8.61X×104+1×102，r=0.9999，平均回收率為101.8%，RSD=2.78（n=6）。結(jié)論 該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于三黃片中鹽酸小檗堿的含量測定。

三黃片；鹽酸小檗堿；薄層掃描法

三黃片清熱解毒，泄火通便，因其療效確切，價(jià)廉物美，從而深受老百姓的喜愛。三黃片收載于《中國藥典》（2010版一部，下同）[1]，其處方組成有大黃、鹽酸小檗堿、黃芩浸膏三味，故而習(xí)稱“三黃”。有關(guān)三黃片中鹽酸小檗堿的含量測定方法，文獻(xiàn)報(bào)道有紫外分光光度法、離子對萃取比色法、高效液相色譜法[2～4]，前二者專屬性差，易受其他小檗堿類生物堿的干擾。后者色譜峰有無干擾，驗(yàn)證較為困難。本試驗(yàn)采用薄層熒光掃描法測定其含量，操作簡便，專屬性好，靈敏度高，結(jié)果直觀可靠，可用于三黃片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Camag TLC Scanner3型薄層掃描儀（瑞士卡瑪）；Camag Linomat 5型半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪）；BP211D型電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；高效硅膠G薄層板（天津思利達(dá)色譜技術(shù)有限公司）。

鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，110713-200609）；大黃、黃芩（飲片）為市售商品，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中國藥典2010年版》規(guī)定）；三黃片（為市售商品）；所有試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)溶液的制備

2.1.1 對照品溶液：取105℃干燥5 h的鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加乙醇適量溶解并制成每1 mL含鹽酸小檗堿0.2 mg的溶液（0.2 mg/mL）。再精密量取上述溶液適量，分別加乙醇稀釋成每1 mL含鹽酸小檗堿0.04 mg （0.04 mg/mL）和每1 mL含鹽酸小檗堿0.01 mg（0.01 mg/mL）的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液：取本品20 片，充分研細(xì)，精密稱取4/5片量（相當(dāng)于鹽酸小檗堿4 mg），置50 mL容量瓶中。加鹽酸-乙醇（1∶100）適量，振搖提取30 min，定容，搖勻。過濾或離心，取續(xù)濾液或上清液，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液：按《中國藥典》“三黃片”項(xiàng)下[處方]的1/10量備料，同[制法]制成不含鹽酸小檗堿的三黃片陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.2 薄層層析條件

薄層板：高效硅膠G薄層板。展開劑：苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.3），另槽內(nèi)加入等體積的濃氨水，預(yù)平衡15 min。展距：4 cm。取出，熱風(fēng)吹干展開劑并至無氨臭。點(diǎn)樣方式：半自動(dòng)點(diǎn)樣。點(diǎn)樣帶寬：6 mm。

2.3 薄層掃描條件

熒光掃描：激發(fā)波長366 nm，光束狹縫10.0mm×0.4mm。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.4.1 重復(fù)性：吸取供試品溶液適量，在同一薄層板上點(diǎn)樣6點(diǎn)，每點(diǎn)1.0 μL，展開，取出，熱風(fēng)吹干，掃描測定斑點(diǎn)峰面積積分值，結(jié)果RSD＝1.28%。

2.4.2 分離度：供試品色譜圖中，只有鹽酸小檗堿一個(gè)斑點(diǎn)，無其他雜質(zhì)成分，分離度符合要求（圖1）。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 陰性試驗(yàn)：于同一薄層板上，分別點(diǎn)以供試品溶液、陰性樣品溶液及鹽酸小檗堿對照品溶液（0.04 mg/mL）各1 μL，如法展開、掃描。結(jié)果，陰性樣品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上無其他成分干擾（圖1）。

圖1 陰性試驗(yàn)色譜圖

2.5.2 最低檢出量：于同一薄層板上，分別依次精密點(diǎn)以鹽酸小檗堿對照品溶（0.01mg/mL）0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μL，每量兩點(diǎn)。如法展開、掃描，結(jié)果點(diǎn)樣為0.1、0.2 μL的斑點(diǎn)不能積分，故認(rèn)為本方法實(shí)驗(yàn)條件下最低檢出量為4.0 ng（圖2）。

圖2 最低檢出量試驗(yàn)

2.5.3 線性關(guān)系考察：取0.04 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液（實(shí)際濃度0.03468 mg/mL），于同一薄層板上，分別依次精密點(diǎn)以上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL，每量兩點(diǎn)、按量循環(huán)點(diǎn)樣，如法展開、掃描。以點(diǎn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，各點(diǎn)樣量斑點(diǎn)峰面積積分值均數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)作圖，得一直線?；貧w方程：Y = 8.61X × 104 +1×102，r =0.9 999，線性范圍 17.3 ng～0.1214 μg （圖3）。

圖3 線性關(guān)系試驗(yàn)

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號樣品，照“樣品的測定”方法項(xiàng)下操作，稱取6份，如法測定含量，結(jié)果RSD＝1.36%（n=6）。

2.5.5 中間精密度試驗(yàn)：邀請本實(shí)驗(yàn)室另一同行進(jìn)行操作，如法稱取6份，測定含量，結(jié)果RSD＝1.71%（n=6）。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取新制備的供試品溶液，如法測定含量，以第一次試驗(yàn)結(jié)果作為0小時(shí)的含量，以后每2小時(shí)測定1次，共測定5次。結(jié)果RSD=1.98%，表明供試品溶液中鹽酸小檗堿在測定期間穩(wěn)定。

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn)：取已測得鹽酸小檗堿含量的三黃片樣品20片，稱定重量，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于鹽酸小檗堿2 mg），置于50 mL容量瓶中，精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液（0.2 mg/mL） 10 mL和鹽酸0.1 mL，加鹽酸-乙醇（1∶100）適量，振搖提取30 min，鹽酸-乙醇（1∶100）定容，搖勻。過濾或離心，取續(xù)濾液或上清液，作為供試品溶液。依法測定含量，重復(fù)試驗(yàn)6 次。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery test

2.6 樣品的測定

取樣品如法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1 μL、鹽酸小檗堿對照品溶液（0.2 mg/mL）1 μL、3 μL，交叉點(diǎn)于同一薄層板上，供試品溶液點(diǎn)樣3點(diǎn)，對照品溶液每量點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)。如法展開、掃描，計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果測定5個(gè)廠家9個(gè)批號的三黃片中鹽酸小檗堿的含量分別為：2.37、2.29、2.87、3.07、2.74、2.91、2.88、3.32、3.10 mg/片（n=2）。

3 討 論

3.1 將展開后的鹽酸小檗堿斑點(diǎn)進(jìn)行吸收光譜掃描（200～700 nm），鹽酸小檗堿在280nm、345nm、430nm處分別有吸收峰值（圖4），故有文獻(xiàn)采用吸收掃描法測定制劑中鹽酸小檗堿的含量[5]。本方法選擇用熒光掃描法，靈敏度顯著提高。

圖4 鹽酸小檗堿斑點(diǎn)的光譜掃描圖

3.2 本實(shí)驗(yàn)采用國產(chǎn)薄層板，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)的變形和擴(kuò)散，影響含量測定的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)表明，選擇點(diǎn)樣帶寬6.0 mm。全斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度積分，重現(xiàn)性較好。

3.3 比較了乙醇、鹽酸-乙醇（1∶100）、鹽酸-甲醇（1∶100）、氯化鈣-乙醇（1→100）作為供試品溶液的提取溶劑，結(jié)果后三者提取效率相當(dāng)，且明顯高于前者。故本方法選擇鹽酸-乙醇（1∶100）為提取溶劑。

同時(shí)比較了鹽酸-乙醇（1∶100）對樣品中鹽酸小檗堿分別在10、20、30、40、50、60 min時(shí)的提取率。結(jié)果表明，30 min時(shí)鹽酸小檗堿的提取率達(dá)到最大，可以認(rèn)為提取30 min可以達(dá)到提取完全。

分別稱取等量樣品，比較用鹽酸-乙醇（1∶100） 50 mL一次性振搖提取30 min和分次振搖提取，每次5 mL至溶液無色，結(jié)果表明兩種提取方法效果相當(dāng)，故選擇溶劑一次性提取30 min，可使測定操作更加簡便。

圖5 個(gè)別三黃片樣品的薄層色譜圖

3.4 經(jīng)過篩選，實(shí)驗(yàn)所用的展開劑為《中國藥典》一部“黃連”項(xiàng)下（含量測定）用展開劑，分離效果好，Rf值適中。展距過長會(huì)造成斑點(diǎn)的擴(kuò)散和變形，本方法展距4cm，即能達(dá)到理想的分離效果，且耗時(shí)短，速度快。

3.5 本測定方法可滿足絕大多數(shù)樣品的定量分析。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有個(gè)別的批號的樣品，在鹽酸小檗堿斑點(diǎn)下方，出現(xiàn)1～3個(gè)雜質(zhì)斑點(diǎn)，但不影響測定。之后經(jīng)TLC對比試驗(yàn)證實(shí)，該雜質(zhì)斑點(diǎn)系黃連藥材中的其他生物堿。（圖5）

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:328

[2] 周文梟,曾立威,劉偉林. HPLC測定三黃片中鹽酸小檗堿的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2004,19(3):220.

[3] 朱穎虹,張清民.三黃片中鹽酸小檗堿的含量測定方法[J].中成藥,2002,24(1):29.

[4] 張清民,朱穎虹,羅小英,等.三黃片中鹽酸小檗堿的含量測定方法的改進(jìn)[J].中國藥師,2002,5(8):502.

[5] 吳珍.雙波長薄層掃描法測定黃連丸中鹽酸小檗堿的含量[J].時(shí)珍國藥研究,1996,7(5):282.

R282.710.3

B

1671-8194（2013）22-0084-03

*通訊作者:E-mail: njutwbt@126.com