傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌多重?zé)晒釶CR方法的評(píng)估及臨床應(yīng)用

馬淑貞石曉路林一曼邱亞群李迎慧扈慶華

（1 深圳市龍崗區(qū)龍崗預(yù)防保健所，廣東 深圳 518116；2 深圳市疾病預(yù)防和控制中心，廣東 深圳 518055）

傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌多重?zé)晒釶CR方法的評(píng)估及臨床應(yīng)用

馬淑貞1石曉路2林一曼2邱亞群2李迎慧2扈慶華2

（1 深圳市龍崗區(qū)龍崗預(yù)防保健所，廣東 深圳 518116；2 深圳市疾病預(yù)防和控制中心，廣東 深圳 518055）

目的 建立和評(píng)估多重?zé)晒釶CR方法快速鑒定傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌的方法，并應(yīng)用于臨床血培養(yǎng)樣品的檢測(cè)。方法 收集留取醫(yī)院的可疑傷寒患者的血培養(yǎng)標(biāo)本，用多重實(shí)時(shí)熒光PCR法和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法同時(shí)進(jìn)行分離鑒定，分析比較雙盲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，評(píng)價(jià)多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度、特異度等檢測(cè)性能指標(biāo)。結(jié)果 共檢測(cè)臨床樣本538例，多重?zé)晒釶CR法檢出陽(yáng)性218例，比傳統(tǒng)培養(yǎng)法多檢出6例；陰性320例，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致。以傳統(tǒng)檢測(cè)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，多重?zé)晒釶CR方法的靈敏度為100%，特異度為98.2%。結(jié)論 建立的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，可快速、特異、靈敏地檢測(cè)出傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌，可以應(yīng)用于臨床標(biāo)本的早期快速分型診斷，提升重大傳染病的應(yīng)急處置能力和監(jiān)測(cè)能力。

多重?zé)晒釶CR；傷寒沙門菌；甲型副傷寒沙門菌；乙型副傷寒沙門菌；丙型副傷寒沙門菌

目前傷寒、副傷寒的實(shí)驗(yàn)室診斷仍為傳統(tǒng)的血液培養(yǎng)方法及肥達(dá)氏反應(yīng)[1-4]，因傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)（5～7d），更由于抗生素的普遍使用，培養(yǎng)率較低，難以達(dá)到早期診斷目的。而肥達(dá)氏反應(yīng)操作繁雜，結(jié)果不易觀察，其敏感性、特異性和重復(fù)性均不夠理想。近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，熒光PCR以其快速、特異性好、封閉操作和無(wú)需PCR后處理等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于微生物的檢測(cè)[5-6]。本文根據(jù)傷寒、副傷寒沙門菌vi抗原基因（viaB）[7]、H抗原基因（flic-a）[8]和O抗原合成基因（rfbS和rfbE）[9]等為靶基因設(shè)計(jì)引物和改良分子信標(biāo)探針，建立多重?zé)晒釶CR方法，對(duì)臨床疑似傷寒、副傷寒患者的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè)，分析比較雙盲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，評(píng)價(jià)多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度、特異度等檢測(cè)性能指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2011年5月至2012年4月臨床疑似傷寒、副傷寒患者血液標(biāo)本538份，非傷寒副傷寒疑似患者血液標(biāo)本300份。每份標(biāo)本采集2管患者血液，每管10mL。

1.1.2 主要試劑和儀器

法國(guó)梅里埃的BacT/ALERT 3D全自動(dòng)微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，安捷倫的Mx3005P熒光PCR儀。一次性全封閉血培養(yǎng)瓶，購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。鎂離子、dNTP、Taq酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自Qiagen（QIAamp DNA Mini Kit， Cat No.51304）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的制備

無(wú)菌操作采集靜脈血后，立即注入BacT/ALERT系統(tǒng)專用血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，成人瓶需8～10mL，小兒瓶需1～3mL，立即送實(shí)驗(yàn)室放入BacT/ ALERT 3D全自動(dòng)微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)。每隔6h無(wú)菌注射器吸取1mL血培養(yǎng)液體進(jìn)行PCR和細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，直至血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后停止取樣和檢測(cè)。

1.2.2 血培養(yǎng)樣品DNA模板的提取方法

血培養(yǎng)樣品用4種方法提取DNA模板：①商業(yè)化的Qiagen DNA提取試劑盒（QIAamp DNAMini Kit，Cat No.51304），按操作說(shuō)明進(jìn)行。②直接水煮離心法：1 m1的血培養(yǎng)液，100℃煮沸5 min.12000 rpm離心2 min，取上清5μL作為熒光PCR模板。③低速離心水煮法：取l mL菌液，按不同的低速離心力和離心時(shí)間處理后，取700 μL上清100℃煮沸5 min，12000 rpm離心2 min，取上清5 μL作為熒光PCR模板。④低速離心，高速富集水煮法：取1 m1菌液，按不同的低速離心力和離心時(shí)間處理后，取700 μL上清12000rpm離心5 min，棄上清。加入50 μL雙蒸水懸浮沉淀，100℃煮沸5 min，12000 rpm離心2 min，取上清5 μL作為熒光PCR模板。

1.2.3 多重?zé)晒釶CR引物及探針

根據(jù)H抗原基因（flic-a）[8]、vi抗原基因（viaB）[9]和O抗原合成基因（rfbS和rfbE）基因序列，自行設(shè)計(jì)引物和探針（序列略），探針的5’端分別標(biāo)記熒光素FAM、HEX、ROX和CY5，由大連寶生物合成并標(biāo)記。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系

25μL反應(yīng)體系含1×buffer（10mM Tris-HCL，50mM KCl），3.5mM MgCl2，0.04～0.06 uM引物，0.05～0.2uM各探針，0.3mMdNTP，1.0U Taq酶，5μLDNA模板。熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3min；95℃ 10s，55℃ 32s，72℃ 15s（共40個(gè)循環(huán)）。使用Mx3005P熒光PCR儀在第二個(gè)循環(huán)周期的55℃退火階段采集FAM、HEX、ROX和CY5通道的熒光數(shù)據(jù)。設(shè)無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。

1.2.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定

按常規(guī)方法進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 血培養(yǎng)樣品的DNA模板的提取方法

血培養(yǎng)樣品的4種提取DNA模板方法中，樣品按Qigen試劑盒方法提取的DNA模板用于PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不到陽(yáng)性信號(hào)，故此方法不適于提取血培養(yǎng)樣品。按直接水煮離心法、低速離心水煮法和低速離心高速富集水煮法提取的DNA模板用于PCR實(shí)驗(yàn)，均檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。但在操作的簡(jiǎn)便性、PCR結(jié)果的重復(fù)性、Ct值、熒光信號(hào)值等方面綜合比較，低速離心水煮法中的1000rpm離心5min的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳。

2.2 多重?zé)晒釶CR法與細(xì)菌分離培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果

在538份臨床診斷疑似傷寒副傷寒病例標(biāo)本中，使用多重?zé)晒釶CR方法檢出陽(yáng)性218例中，細(xì)菌分離培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性212例，即多重?zé)晒釶CR方法比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法多檢出6例陽(yáng)性；陰性320例樣品與細(xì)菌分離培養(yǎng)法結(jié)果一致。與培養(yǎng)法金標(biāo)準(zhǔn)比較，本研究方法檢測(cè)傷寒、副傷寒沙門菌的靈敏度為100%，特異度為98.2%，見(jiàn)表1。

表1 多重?zé)晒釶CR法與分離培養(yǎng)法（金標(biāo)準(zhǔn)）檢測(cè)結(jié)果比較

通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算得出，本研究方法檢測(cè)傷寒、副傷寒沙門菌的靈敏度（真陽(yáng)性率）為100%，特異度（真陰性率）為98.2%。計(jì)算方法如下：

靈敏度（真陽(yáng)性率）=A/（A+C）×100%=212/212×100%=100%

特異度（真陰性率）=D/（B+D）×100% =320/326×100%=98.2%

2.3 不同病程血液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

了解不同病程血液標(biāo)本對(duì)多重?zé)晒釶CR與細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果的影響，分別采集不同病程患者血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，病程在1～2周的檢出陽(yáng)性率為最高，詳見(jiàn)表2。

3 討 論

沙門菌（Salmonella）是廣泛分布于自然界中的常見(jiàn)致病菌之一。傳統(tǒng)的沙門菌的分型工作存在諸多不足，特別是對(duì)高度相似的菌株進(jìn)行分型時(shí)表現(xiàn)的尤為明顯。近年隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是PCR以其快速等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于微生物的檢測(cè)。但普通PCR臨床檢測(cè)技術(shù)每個(gè)反應(yīng)只能擴(kuò)增1個(gè)模板，產(chǎn)物需要開(kāi)蓋進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，易造成交叉污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性；也不能短時(shí)間內(nèi)完成大批量樣品多種指標(biāo)檢測(cè)。熒光PCR是公認(rèn)的高敏感、高特異檢測(cè)方法，其操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)需后處理，避免了產(chǎn)物交叉污染的可能。多重?zé)晒釶CR方法是在常規(guī)熒光PCR法基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)，在同一個(gè)反應(yīng)體系中混合多套引物和探針，通過(guò)探針上不同波長(zhǎng)的發(fā)光基團(tuán)可同時(shí)對(duì)多種病原菌進(jìn)行區(qū)別性檢測(cè)，具有快速、靈敏、特異、高通量等優(yōu)點(diǎn)。

表2 不同病程血液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

本文成功建立了傷寒、甲、乙、丙型副傷寒多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，并建立了簡(jiǎn)易的血培養(yǎng)物的處理方法。該法對(duì)538例臨床血液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)法金標(biāo)準(zhǔn)比較，多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的靈敏度為100%，特異度為98.2%，表明該多重?zé)晒釶CR方法同時(shí)檢測(cè)傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌具有簡(jiǎn)便、快速、高效、特異、敏感的特點(diǎn)，為臨床傷寒、副傷寒的早期快速分型診斷提供了一個(gè)新的診斷方法?？梢詰?yīng)用于臨床標(biāo)本的早期快速分型診斷，提升重大傳染病的應(yīng)急處置能力和監(jiān)測(cè)能力。

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Assessment and Application of a Multiplex Real-time PCR Assay for Rapid Detection of S typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B and S. Paratyphi C

MA Shu-zhen1, SHI Xiao-lu2, LIN Yi-man2, QIU Ya-qun2, LI Ying-hui2, HU Qing-hua2
(1 Shenzhen Longgang Preventive Health, Shenzhen 518116, China; 2 Shenzhen Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518055, China)

Objective To establish and evaluate a rapid multiplex real-time PCR(m-rt-PCR) assay for the simultaneous detection of S typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B and S. paratyphi C. The method could be applied to the rapid diagnosis of clinical blood samples. Methods Suspected blood cultures were collected to simultaneously detect S. Typhi, S. Paratyphi A, B and C by m-rt-PCR assay and standard culture methods. The results of the m-rt-PCR assay were compared with those obtained from traditional culture based methods using a 2×2 table to estimate indices of sensitivity and specificity. Results 538 unknown clinical samples were analyzed by culture, 212 were culture positive. Multiplex real-time PCR detected 218 positive samples. In comparison with culture method, clinical validation showed 100% sensitivity and 98.2% specificity. Conclusion The real -time PCR assay was simple, rapid, sensitive and specific. It could be applied to the rapid diagnosis of S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C and S typhi. The established assay should increase the speed of detection and differentiation of typhoid fever causing organisms in a diagnostic setting.

Multiplex real-time PCR assay; S typhi; S. paratyphi A; S. paratyphi B; S. paratyphi C

R446.5

B

1671-8194（2013）22-0001-02

2012年深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（醫(yī)療衛(wèi)生非資助）（編號(hào)：201203360），國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81071433）