二角菱殼和四角菱殼不同提取物抗氧化能力比較研究※

裴 剛胡喬銘向德標(biāo)羅李娜丁揚(yáng)洲袁 園

二角菱殼和四角菱殼不同提取物抗氧化能力比較研究※

裴 剛1胡喬銘2向德標(biāo)2羅李娜2丁揚(yáng)洲2袁 園1

目的研究不同菱角殼不同溶劑的提取物的抗氧化能力。方法采用DPPH法分別測(cè)定二角菱角殼、四角菱角殼氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水提取浸膏的抗氧化能力，同時(shí)與抗壞血酸、槲皮素、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果用同一溶劑提取時(shí)，二角菱殼提取浸膏的 IC50值均高于四角菱殼提取浸膏；同一種菱角殼用不同溶劑提取時(shí)，其提取浸膏與標(biāo)準(zhǔn)品相比 IC50值為：氯仿浸膏＞水浸膏＞乙醇浸膏＞抗壞血酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞沒(méi)食子酸，即其清除 DPPH自由基能力的順序?yàn)椋簺](méi)食子酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞抗壞血酸＞乙醇浸膏＞水浸膏＞氯仿浸膏。結(jié)論菱角殼具有較好的抗氧化能力。四角菱殼抗氧化能力強(qiáng)于二角菱殼，菱角殼乙酸乙酯提取部分清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)。

氧自由基；DPPH；二角菱殼；四角菱殼

菱角為菱科植物菱或細(xì)果野菱的干燥果實(shí)[1]。前期的工作顯示，浙江產(chǎn)二角菱殼（Trapa bicornis Var.bispinosa）和湖南產(chǎn)四角菱殼（Trapa natans L.Var.incisa Makino）提取物對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用[2]。誘發(fā)腫瘤的因素很多，現(xiàn)代研究表明，腫瘤的始發(fā)和促生階段具有氧自由基形成及出現(xiàn)細(xì)胞增殖水平的增高，因此清除氧自由基核抑制細(xì)胞增殖水平成為預(yù)防和治療腫瘤的一項(xiàng)措施[3]。DPPH自由基結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定、反應(yīng)容易控制，是抗氧化劑自由基清除活性篩選的常用試劑；DPPH比色法也僅需要分光光度計(jì)，簡(jiǎn)單、方便，實(shí)驗(yàn)條件容易滿足[4]。本文以不同溶劑對(duì)上述菱角殼進(jìn)行提取，研究提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力，為菱角殼的抗癌藥理活性探索提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器UV-1750紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）；AL204型電子分析天平（梅特勒托利多公司）；FW135中藥材粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料菱角于2010年10月分別采于浙江和湖南，經(jīng)中南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院植物學(xué)教研室馬英姿副教授鑒定分別為菱科植物二角菱（Trapa bicornis Var.bispinosa）和四角菱（Trapa natans L.Var.incisa Makino）的干燥果實(shí)。標(biāo)本存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室。

1.3 試劑DPPH（1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）；抗壞血酸、槲皮素、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；其余試劑均為AR。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菱角殼提取浸膏制備稱取二角菱殼、四角菱殼藥材粗粉各33.7g、34.4g，用濾紙包好分別置于索氏提取器中，按極性由小到大的順序依次用氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水，加熱回流提取3h。分別回收溶劑，水浴蒸干，干燥器內(nèi)干燥 24h，得黑褐色浸膏，稱重，則得到 8個(gè)樣品即二角菱殼氯仿浸膏1.2g，四角菱殼氯仿浸膏 1.3g，二角菱殼乙酸乙酯浸膏5.5g，四角菱殼乙酸乙酯浸膏4.2g，二角菱殼乙醇浸膏7.6g，四角菱殼乙醇浸膏5.5g，二角菱殼水浸膏2.5g，四角菱殼水浸膏1.8g。

2.2 試液的制備

2.2.1 DPPH溶液的配制精密稱取DPPH10mg，溶于少量95%乙醇中，定容至250mL，即得濃度為0.04mg/mL 溶液，置于冰箱中冷藏備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取抗壞血酸、槲皮素、沒(méi)食子酸對(duì)照品20.3mg、20.4mg、10.1mg，分別置于100mL容量瓶中，加入95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得 203μg/mL抗壞血酸對(duì)照品溶液、204μg/mL槲皮素對(duì)照品溶液、101μg/mL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，再參考文獻(xiàn)，按2倍倍比稀釋分別得抗壞血酸、槲皮素、沒(méi)食子酸相應(yīng)的8個(gè)不同濃度藥液。

2.2.3 供試品溶液制備精密稱取 2.1中制備的各樣品20.1mg、39.0mg、4.2mg、4.1mg、8.5mg、4.3mg、8.1mg、8.1mg，分別用相應(yīng)溶劑溶解并定容至10mL，搖勻，得2.01、3.90、0.42、0.41、0.85、0.43、0.81、0.81mg/mL的第一濃度初始液，再按2倍倍比稀釋分別得樣品B1-B8相應(yīng)的8個(gè)不同濃度藥液。

2.3 DPPH自由基穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取濃度為203μg/mL的抗壞血酸和濃度為3.90mg/mL的樣品B1溶液，按照2.4.1項(xiàng)下方法加樣，每隔2 min測(cè)定吸光度值A(chǔ)i，直到Ai值基本穩(wěn)定。吸光度值A(chǔ)i在加入抗氧化劑的最初20min內(nèi)下降較快，在20～30min內(nèi)，反應(yīng)體系的Ai值變化緩慢，30min后Ai值基本保持不變。因此選擇測(cè)定菱殼提取浸膏與DPPH自由基的反應(yīng)時(shí)間為30min。

2.4 清除DPPH能力的測(cè)定方法

2.4.1 清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)精密量取DPPH溶液2.5mL、對(duì)照品溶液和供試品溶液分別為0.5mL，于510nm處測(cè)定各吸光值（A），每一吸光值平行測(cè)定3次，按下公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

2.4.2 半清除率的測(cè)定按 2.4.1下的操作步驟測(cè)定待測(cè)液DPPH自由基清除率，繪制DPPH自由基清除率對(duì)待測(cè)液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)線性方程計(jì)算出DPPH自由基清除率為50%時(shí)所需對(duì)照品、不同菱角殼提取浸膏濃度，即IC50值。IC50值越低，DPPH自由基清除率達(dá)50%時(shí)所需抗氧化劑濃度越低，表明該抗氧化劑清除自由基的能力越強(qiáng)。

3 結(jié)果與討論

通過(guò)測(cè)定各抗氧化劑清除DPPH能力的指標(biāo)為IC50值，其比較結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1 抗氧化劑濃度與清除率關(guān)系

由表 1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同種類菱角殼用同一溶劑提取時(shí)，二角菱殼提取浸膏的 IC50值均高于四角菱殼提取浸膏，即四角菱殼提取浸膏清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于二角菱殼提取浸膏；同一種菱角殼用不同溶劑提取時(shí)，其提取浸膏與標(biāo)準(zhǔn)品相比 IC50值為：氯仿浸膏＞水浸膏＞乙醇浸膏＞抗壞血酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞沒(méi)食子酸，即其清除 DPPH自由基能力的順序?yàn)椋簺](méi)食子酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞抗壞血酸＞乙醇浸膏＞水浸膏＞氯仿浸膏，乙酸乙酯部分清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)。表明菱角殼中主要的抗氧化活性成分溶于乙酸乙酯等極性溶劑中，其中的弱極性成分不具備良好的抗氧化能力，則奠定了以后的分離抗氧化活性單體實(shí)驗(yàn)中以乙酸乙酯浸膏為主的基礎(chǔ)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版一部)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)出版社.附錄[III],2010.

[2] 伍茶花,丁揚(yáng)州,裴剛,等.不同菱角殼提取物對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(1)：27-30.

[3] 尹衛(wèi)平,梁菊,吳文瀾.抗癌天然藥物研究進(jìn)展[M].北京：科學(xué)出版社,2009.

[4] 寧杰,岳峰,巴媛媛,等.甜菊葉提取物清除DPPH 能力的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2011,11(6)：27-34.

R917

A

1673-5846(2013)07-0225-02

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410208

2湖南中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，湖南長(zhǎng)沙 410208

湖南省教育廳資助項(xiàng)目(12C0272)；2011年度湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目課題資助；2012年度湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新性課題資助

袁園（1984-），女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師；研究方向：中藥及其復(fù)方化學(xué)成分研究；E-mail：yykakashi@163.com，電話：13787208503。