構(gòu)建伴有β-葡萄糖苷酶表達的乙醇發(fā)酵大腸桿菌

張瑤，羅紫臣，高秋強，鮑杰

華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237

將纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵組合在一起進行纖維素乙醇的生產(chǎn)被稱之為整合生物加工工藝(Consolidated bioprocessing,CBP)，具備這3個功能的發(fā)酵菌種被稱之為整合生物加工菌種，這一工藝是木質(zhì)纖維素生物煉制的重要方向之一[1-2]。在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 等傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌株中采用表面展示(Surface display)纖維素酶或纖維小體，從而構(gòu)建纖維素乙醇CBP 菌株是目前最主要的研究潮流[3]。Zhao 等[4-5]在酵母表面組裝一系列不同功能的纖維小體，獲得能夠代謝磷酸浸泡微晶纖維素(PASC)得到乙醇的兩株重組菌HZ1886(CipA3-EGII-CBHII-BGL1)和HZ1885(CipA1-EGII-CBHII-BGL1)，此外，通過在釀酒酵母表面裝載來源于熱纖維梭菌Clostridium thermocellum 的纖維小體，得到重組菌S.cerevisiae strain L2612能夠利用D-木糖生產(chǎn)乙醇。Kondo 等[6]在S.cerevisiae 中表面展示了來源于棘孢曲霉Aspergillus aculeatus 的β-葡萄糖苷酶bglI，Kotaka 等[7]在釀酒酵母表面展示了來自米曲霉Aspergillus oryzae 的β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切葡聚糖酶基因，并以β-葡聚糖作為底物進行乙醇發(fā)酵，轉(zhuǎn)化率達到理論值的69.6%。Ryu 等[8]則在大腸桿菌中導(dǎo)入乙醇路徑，同時表面展示來源于解纖維梭菌 Clostridium cellulolyticum 的3種纖維素酶，以稀酸處理的玉米秸稈為底物獲得乙醇。

在使用表面展示方法進行纖維素酶和纖維小體的表達時，纖維素酶的分布局限于細胞表面，酶量受限于表面的結(jié)合位點，且與底物木質(zhì)纖維素的接觸空間有限，不利于催化反應(yīng)。同時，表面展示過程相對復(fù)雜，需要多種輔助蛋白并且跨膜分泌[9-10]。分泌表達纖維素酶也是一種重要的構(gòu)建CBP 菌株的思路，通過在生物體內(nèi)構(gòu)建新的分泌表達體系或者利用自有的分泌體系將纖維素酶分泌到胞外，進入反應(yīng)體系水解纖維質(zhì)。分泌表達的纖維素酶可以與底物充分接觸，并隨著發(fā)酵的進行，不斷地在反應(yīng)體系內(nèi)積累，相應(yīng)的催化能力也隨之增強。同時分泌表達系統(tǒng)相對簡單，可通過啟動子的強弱和信號肽的種類來控制分泌能力的強弱，調(diào)整體系內(nèi)各類纖維素酶的比例，形成良好的協(xié)同作用。

由于大腸桿菌遺傳背景清楚、繁殖快、基因操作成熟，所以本文選用大腸桿菌為出發(fā)菌株。纖維素降解酶系是由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成，其中β-葡萄糖苷酶可將纖維二糖水解生成葡萄糖，從而減少纖維二糖的積累及酶解過程的反饋抑制，是纖維素水解的最后一步。且相比纖維素酶和半纖維素酶作用的底物是不溶性的大分子，β-葡萄糖苷酶的底物纖維二糖為可溶分子，容易精確測定,因此相比另外兩類纖維素酶，更適于CBP 菌株分泌表達的研究[11-14]。首先通過Red 重組，將來源于運動發(fā)酵單胞菌 Zymomonas mobilis ZM4的丙酮酸脫羧酶基因pdc 和乙醇脫氫酶基因adhB 整合到大腸桿菌JM109基因組，構(gòu)建了一株可以進行乙醇發(fā)酵的菌株E.coli P81。之后，選擇將對纖維二糖具有較高專一性的來自多粘芽胞桿菌Bacillus polymyxa β-葡萄糖苷酶基因bglB[15]克隆到E.coli P81，構(gòu)建得到一株能夠分泌β-葡萄糖苷酶到胞外的重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)，實現(xiàn)了纖維二糖為碳源進行乙醇發(fā)酵的整合生物加工。本工作為今后構(gòu)建實用的纖維素酶分泌表達型的乙醇發(fā)酵CBP 工程菌提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

本實驗中所用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。其中Escherichia coli JM109作為基因pdc、adhB的整合宿主菌，E.coli DH5α用于基因的克隆和篩選，運動發(fā)酵單胞菌 Zymomonas mobilis ZM4(ATCC 31821)是基因pdc、adhB 的來源菌株，多粘芽胞桿菌Bacillus polymyxa1.794是基因bglB 的來源菌株。

RM 培養(yǎng)基：20 g/L 葡萄糖、10 g/L 酵母浸出物、2 g/L KH2PO4。SOC 培養(yǎng)基：20 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母浸出物、0.5 g/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2、20 mmol/L 葡萄糖。M9基本培養(yǎng)基：6 g/L Na2HPO4、3 g/L K3PO4、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、2 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L CaCl2。

Taq、Primer STAR 聚合酶和pMD19-T 載體購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；質(zhì)粒抽提、瓊脂糖凝膠試劑盒購自上海捷瑞生物工程公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工生物工程公司。Qiagen 基因組抽提試劑盒購自美國Qiagen 公司；葡萄糖試劑盒購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所。

大腸桿菌 JM109、DH5α的培養(yǎng)條件為37℃、200 r/min，含有溫敏質(zhì)粒pKD46、pCP20時培養(yǎng)條件為30℃、200 r/min。運動發(fā)酵單胞菌ZM4在RM 培養(yǎng)基中30℃靜置厭氧培養(yǎng)，多粘芽胞桿菌的培養(yǎng)條件為37℃、220 r/min。實驗中使用的卡那霉素和氨芐青霉素終濃度如無特別標(biāo)明，均為100μg/mL。發(fā)酵實驗中種子在裝有5 mL LB 的試管內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵在250 mL的錐形瓶中進行，裝液量為50 mL。

表1 本實驗中所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 基因pdc、adhB 和bglB 的克隆

運動發(fā)酵單胞菌Z.mobilis ZM4、多粘芽胞桿菌B.polymyxa 1.794和大腸桿菌的基因組使用Qiagen 基因組抽提試劑盒提取。以Z.mobilis ZM4的全基因組為模板，高保真酶Primer STAR為聚合酶擴增基因pdc、adhB，在PCR 產(chǎn)物中加入r-Taq 聚合酶72℃保溫20 min，添加A 尾巴。以質(zhì)粒pGEX-4T-1為模板克隆啟動子Ptac后，利用Overlap PCR 將基因pdc、adhB 連接到啟動子Ptac下游，得到質(zhì)粒T-Ptac-pdc-adhB。以質(zhì)粒pKD4為模板，根據(jù)丙酮酸甲酸裂解酶pflA、pflB 的基因序列，擴增兩翼各包含一段長為40 bp 的pfl 基因兩端序列的片段kan。

以多粘芽胞桿菌B.polymyxa 1.794基因組為模板克隆β-葡萄糖苷酶基因bglB，通過酶切連接到載體pUC19，并添加啟動子P43和信號肽NprB 輔助其分泌表達，構(gòu)建質(zhì)粒pUC19-P43-NprB-bglB。

表2 本實驗中所用的引物序列Table 2 Primers used in this study

1.3 大腸桿菌Red 重組及重組菌的篩選

在電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞中加入總計500 ng 的電轉(zhuǎn)樣品，混勻，冰浴30 min 后轉(zhuǎn)入0.1 cm 預(yù)冷的電擊杯，用電轉(zhuǎn)儀(Gene PulserXellTM，BIO-RAD)電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)條件為：200?，25μF，2000 V，4～5 ms[16-18]。電擊后立即加入SOC 培養(yǎng)基，37℃、150 r/min 孵育1 h 后，涂布于含25μg/mL 含卡那霉素的LB 平板，37℃培養(yǎng)(重組原理見圖1)，于含高濃度卡那霉素(100μg/mL)的LB 抗性平板上復(fù)篩，并通過菌落PCR 鑒定、篩選。

抗性標(biāo)記基因的消除：將輔助質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)入Red 重組后的陽性菌株內(nèi)，30℃培養(yǎng)8 h后，轉(zhuǎn)接，在42℃培養(yǎng)12 h，消除質(zhì)粒pCP20。涂布于LB 平板37℃培養(yǎng)，將長出的單菌落分別在LB 與含氨芐青霉素、卡納青霉素的LB 平板上劃線，37℃培養(yǎng)12 h，獲得對兩種抗生素均敏感的克隆[19]。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活測定

圖1 Red 重組方法在E.coli 基因組上整合乙醇代謝路徑基因pdc 和adhBFig.1 Integration of ethanol fermentation pathway genes pdc and adhB into E.coli genome DNA by Redre combination method.

粗酶液的制備：培養(yǎng)12 h 的菌株按1%接種量接種于LB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600為2，10000 r/min、4℃離心5 min，將上清冰浴，緩慢加入55%飽和度的研磨硫酸銨，同時不斷攪拌，沉淀上清中的蛋白，10000 r/min、4℃離心10 min，去上清后用1 mL預(yù)冷的50 mmol/L 的檸檬酸緩沖液(pH 6.0)溶解沉淀，即為發(fā)酵液粗酶液；將離心得到的菌體用預(yù)冷的50 mmol/L 的檸檬酸緩沖液(pH 6.0)洗滌兩次后，用1 mL 檸檬酸緩沖液懸浮，超聲破碎后，10000 r/min、4℃離心，上清即為全細胞粗酶液；另取離心后所得的菌體，用超純水洗滌2次后，加入含20%(W/V)蔗糖、0.5 mmol/L Na2EDTA 的33 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液懸浮菌體，在室溫孵育10 min 后，8000 r/min、4℃離心8 min 去上清，隨后加入超純水懸浮菌體，室溫孵育10 min，8000 r/min 4℃離心8 min，上清即為周質(zhì)粗酶液[20]；將制備周質(zhì)粗酶液時離心所得的細胞超聲破碎，10000 r/min、4℃離心，上清即為細胞質(zhì)粗酶液。

以對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)作為底物測定β-糖苷酶酶活[21]。1 U 酶活定義為規(guī)定條件下1 min 之內(nèi)釋放出1μmol 的對硝基苯酚所對應(yīng)的酶量。在2 mL 的反應(yīng)體系中，先加入0.8 mL 檸檬酸緩沖液(100 mmol/L，pH 6.0)以及1 mL 8 mmol/L pNPG (由50 mmol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液溶解)，37℃預(yù)熱后加入0.2 mL的經(jīng)過適當(dāng)稀釋的粗酶液，在37℃條件下反應(yīng)10 min，加入1 mL 的0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，最后在405 nm 處測定吸光度值(酶空白為：1 mL 檸檬酸緩沖液+1 mL 8 mmol/L pNPG；底物空白為：1.8 mL 檸檬酸緩沖液+0.2 mL 粗酶液)。

以纖維二糖為底物測定纖維二糖酶的酶活。1U 纖維二糖酶活定義為規(guī)定條件下1 min 催化纖維二糖生成1μmol 的葡萄糖所需的酶量[22]。在2 mL 的反應(yīng)體系中，先加入1 mL 80 mmol/L的纖維二糖(由100 mmol/L pH 6.0的檸檬酸緩沖液溶解)，37℃預(yù)熱后加入1 mL 粗酶液，37℃反應(yīng)1 h 后，利用葡萄糖試劑盒測定生成的葡萄糖的量[23]。(酶空白：1 mL 檸檬酸緩沖液+1 mL纖維二糖；底物空白：1 mL 檸檬酸緩沖液+1 mL粗酶液)。

1.5 發(fā)酵與分析

培養(yǎng)12 h 的菌株按1%接種量接種于含有50 mL 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，37℃、200 r/min 培養(yǎng)到OD600為0.2[24]，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃、200 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)。理論上，1分子的纖維二糖水解可得2分子的葡萄糖，1分子的葡萄糖代謝可產(chǎn)生2分子的乙醇，據(jù)此轉(zhuǎn)化纖維二糖、葡萄糖所應(yīng)產(chǎn)生乙醇的量，為乙醇的理論產(chǎn)量，而實際發(fā)酵中代謝所得乙醇與理論上消耗相同量糖產(chǎn)生的乙醇的比值，為實際乙醇的得率，即按照理論得率為100%計算的得率。發(fā)酵液中的乙醇含量和殘余的葡萄糖、纖維二糖的濃度由高效液相色譜進行定量分析，色譜柱(LC-20AD)使用Aminex HPX-87H column(Bio-Rad USA)離子交換柱，流動相為5 mmol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為65℃，采用示差折光檢測器RID-10A (島津公司)，檢測器溫度為40℃。所有的樣品在10000 r/min 離心5 min 后，上清經(jīng)過0.22μm 的濾膜過濾處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡萄糖苷酶分泌型乙醇發(fā)酵工程菌E.coli 的構(gòu)建與酶活測定

通過PCR 克隆得到基因pdc、adhB，及含同源臂的kan 基因，并分別連接到質(zhì)粒pMD19-T進行酶切鑒定。通過Overlap PCR 將pdc-adhB連接到Ptac啟動子下游，得到片段Ptac-pdc-adhB，隨后插入含同源臂的 kan 基因中，與載體pMD19-T 連接，構(gòu)建得到質(zhì)粒 pMD19-kan-Ptac-pdc-adhB (圖2A)。將PCR 克隆得到β-葡萄糖苷酶基因bglB 連接到載體pUC19，得到質(zhì)粒pUC19-P43-NprB-bglB (圖2B)。

圖2 pMD19-kan-Ptac-pdc-adhB 與pUC19-P43-NprB-bglB 的質(zhì)粒圖譜Fig.2 Maps of plasmids.(A) pMD19-kan-Ptac-pdc-adhB.(B) pUC19-P43-NprB-bglB.

以質(zhì)粒 pMD19-kan-Ptac-pdc-adhB 為模板PCR 擴增片段kan-Ptac-pdc-adhB，經(jīng)DpnI 酶處理后電擊轉(zhuǎn)化到E.coli JM109，將片段kan-Ptacpdc-adhB 替換并整合到JM109基因組中丙酮酸甲酸裂解酶pflA、pflB 基因的位點上。抽提重組菌的基因組，利用鑒定引物Jd1、Jd2和Jd3、Jd4(鑒定引物的位置見圖1)進行PCR 鑒定，PCR片段大小正確，證明目標(biāo)基因整合到基因組的靶定位點，將得到的重組菌記為E.coli P8。

進一步在E.coli P8內(nèi)導(dǎo)入輔助質(zhì)粒pCP20消除抗性標(biāo)記基因kan，得到的陽性克隆只能在LB 中生長。抽提重組菌的基因組，鑒定引物Jd1、Jd2進行PCR 無法得到條帶，而引物Jd3、Jd4進行PCR 時得到正確的條帶，證明染色體上卡納青霉素標(biāo)記基因已被刪除，且輔助質(zhì)粒pCP20也已消失，將得到的該重組菌記為E.coli P81。將重組質(zhì)粒pUC19-P43-NprB-bglB 轉(zhuǎn)入重組菌E.coli P81，PCR 和酶切鑒定正確后，將所得的重組菌記為E.coli P81(pUC19-bglB)。

重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)分別以對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)和纖維二糖為底物對β-葡萄糖苷酶的β-糖苷酶活和纖維二糖酶活進行了測定。E.coli JM109是本文中基因操作的原始菌株，而E.coli P81是整合乙醇途徑后得到的改造菌株，為了明確重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)的酶活和發(fā)酵特性，所以轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pUC19后作為對照菌。將對照菌E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)和重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)接種于含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以pNPG 為底物測定β-糖苷酶酶活，結(jié)果如圖3A 所示。重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)發(fā)酵液中β-糖苷酶活可以達到3.62 mU/mL 菌液，周質(zhì)空間的β-糖苷酶活為81.16 mU/mL 菌液，細胞質(zhì)的酶活為20.98 mU/mL菌液，對照菌E.coli P81(pUC19)發(fā)酵液和周質(zhì)空間的β-糖苷酶活分別為0.07 mU/mL、0.36 mU/mL，E.coli JM109(pUC19)發(fā)酵液和周質(zhì)空間的β-糖苷酶活分別為0.03 mU/mL、0.7 mU/mL。

圖3 重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)的β-糖苷酶和纖維二糖酶酶活測定Fig.3 The enzyme activity of E.coli P81(pUC19-bglB).(A) The β-glucosidase activity of BglB.(B) The cellobiase activity of BglB.Culture conditions:37℃,200 r/min.The protein in 20 mL supernatant broth were precipitated by using ammonium sulfate and redissolved in 1 mL 50 mmol/L citric acid buffer (pH 6.0) to give the crude enzyme solution.The glucosidase activities were determined using pNPG substrate at 37℃ for 10 min,the cellobiase activities were determined using cellobiose substrate at 37℃ for 1 h.Strains E.coli JM109(pUC19) and E.coli P81(pUC19)were used as control.

以纖維二糖為底物測定的纖維二糖酶活結(jié)果如圖3B 所示，重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)發(fā)酵液中纖維二糖酶活可以達到0.80 mU/mL 菌液，周質(zhì)空間的纖維二糖酶活為31.54 mU/mL菌液，細胞質(zhì)的酶活為20.76 mU/mL 菌液，對照菌E.coli JM109(pUC19)發(fā)酵液和周質(zhì)空間的纖維二糖酶活分別為0.05 mU/mL、3.18 mU/mL，E.coli P81(pUC19)發(fā)酵液和周質(zhì)空間的纖維二糖酶活分別為0.08 mU/mL、3.04 mU/mL。重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)所表達的β-葡萄糖苷酶大量存在于細胞的周質(zhì)空間內(nèi)，且重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)的胞外酶活遠高于對照菌 E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)，這表明重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)中的bglB 基因得到了高效的表達，且β-葡萄糖苷酶分泌到了胞外。

2.2 纖維二糖為碳源的乙醇發(fā)酵

為檢測重組菌對纖維二糖的利用能力，以纖維二糖為唯一碳源進行發(fā)酵實驗。將 E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)、E.coli P81(pUC19-bglB)接種于含有10 g/L 纖維二糖的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，單一碳源發(fā)酵48 h 后，結(jié)果如圖4所示。對照菌E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)雖然由于種子培養(yǎng)基中的成分隨轉(zhuǎn)接進入發(fā)酵體系，菌體量略微增長，但由于對照菌不具備利用纖維二糖的能力，所以無法以纖維二糖為碳源生長。而 E.coli P81(pUC19-bglB)生長良好，48 h 時OD600增長到了1.9，代謝了2.5 g/L 的纖維二糖，但三株菌都沒有乙醇生成。在含纖維二糖的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)通過分泌表達β-葡萄糖苷酶代謝纖維二糖，以纖維二糖為碳源，可以正常的生長，但沒有乙醇產(chǎn)生，推測可能是由于M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基的營養(yǎng)匱乏，重組菌可以生長但不適宜于其代謝生產(chǎn)乙醇。

圖4 重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)以纖維二糖為唯一碳源的發(fā)酵Fig.4 Ethanol fermentation of E.coli P81(pUC19-bglB)in cellobiose as a sole carbon source.Cellobiose concentration:(▲) for E.coli JM109(pUC19),(■) for E.coli P81(pUC19),(●) for E.coli P81(pUC19-bglB);Growth condition:(△) for E.coli JM109(pUC19),(□)for E.coli P81(pUC19),(○) for E.coli P81(pUC19-bglB).Culture conditions:37℃,200 r/min.Strains E.coli JM109(pUC19) and E.coli P81(pUC19)were used as control.

為驗證重組菌是否能夠利用纖維二糖生產(chǎn)乙醇，在含纖維二糖的LB 培養(yǎng)基中進行發(fā)酵實驗。將重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)和兩株對照菌E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)接種于到含有10 g/L 纖維二糖的LB 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，發(fā)酵48 h 后結(jié)果見圖5A。對照菌E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)可以正常生長，但纖維二糖幾乎沒有利用，也沒有乙醇產(chǎn)生。其中，E.coli JM109(pUC19)既沒有利用纖維二糖的能力，也沒有導(dǎo)入產(chǎn)乙醇途徑，所以可以利用LB 培養(yǎng)基中的組分正常生長，但沒有明顯的乙醇產(chǎn)生。E.coli P81(pUC19)雖然導(dǎo)入了pdc-adhB 途徑，但無法利用纖維二糖，LB 培養(yǎng)基中的成分可支持菌體的生長，而不足以生產(chǎn)乙醇。而重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)發(fā)酵48 h后，代謝了5.9 g/L 纖維二糖，產(chǎn)生1 g/L 乙醇，達到了乙醇理論得率的31.6%。E.coli P81(pUC19)與重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)在含纖維二糖的LB 培養(yǎng)基中產(chǎn)乙醇的差異，說明重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)是以纖維二糖為碳源生產(chǎn)乙醇而非LB中的組分。重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)在含纖維二糖的M9基本培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，其OD600值僅為在含纖維二糖的LB 中的OD600值的一半，說明β-葡萄糖苷酶水解產(chǎn)生的少量葡萄糖尚未能滿足菌體正常的生長所需，菌體處于“饑餓”中，所以葡萄糖被用于菌體的生長，而非被用于乙醇生產(chǎn)，所以沒有乙醇生成。在整個發(fā)酵過程中沒有檢測到葡萄糖的存在，說明纖維二糖水解得到的葡萄糖迅速被重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)利用，避免了葡萄糖的大量積累，將體系中的葡萄糖濃度維持在較低水平。

圖5 重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)發(fā)酵纖維二糖的結(jié)果和相對胞外纖維二糖酶活Fig.5 Ethanol fermentation of E.coli P81(pUC19-bglB) in the LB medium with 10 g/L cellobiose and the relative extracellular cellobiase activity.(A) Fermentation of E.coli P81(pUC19-bglB) in the LB medium with 10 g/L cellobiose,cellobiose concentration:(▲) for E.coli JM109(pUC19),(■) for E.coli P81(pUC19),(●) for E.coli P81(pUC19-bglB);ethanol concentration:(△) for E.coli JM109(pUC19),(□) for E.coli P81(pUC19),(○) for E.coli P81(pUC19-bglB).Strains E.coli JM109(pUC19) and E.coli P81(pUC19) were used as control.(B) The relative extracellular cellobiase enzyme activity and growth condition of E.coli P81(pUC19-bglB) in different time:(×) for growth condition.

重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)在發(fā)酵的中后期的纖維二糖代謝減慢，因此測定了重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)在不同時間的胞外相對纖維二糖酶酶活，結(jié)果如圖5B，在30 h 時菌體生長量達到最大，而胞外纖維二糖酶酶活也最高，之后菌體的OD600值開始下降，胞外的纖維二糖酶酶活也開始降低，原因可能是搖瓶培養(yǎng)中E.coli 菌由于營養(yǎng)減少和發(fā)酵副產(chǎn)物增減，在30 h 后逐漸失去活性。

為檢驗重組菌對纖維二糖的耐受性，進行不同濃度纖維二糖的發(fā)酵實驗。將重組菌 E.coli P81(pUC19-bglB)分別在含10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L 和50 g/L 纖維二糖的LB 培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵48 h 后，結(jié)果見表3。隨著纖維二糖濃度的升高，OD600值也隨之升高，說明重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)對較高濃度的纖維二糖有著良好的耐受性，并分別達到了乙醇理論得率的31.6%、51.2%、55.8%、47.3%和44.7%。纖維二糖濃度的提高對重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)的生長沒有明顯的不利影響，并隨著纖維二糖濃度的提高，菌體量增加，胞外酶也在積累，纖維二糖的代謝量增加，得到的乙醇也在逐步提高。雖然30 g/L 纖維二糖時獲得最高的乙醇理論得率，但考慮到殘余的纖維二糖較多，所以后續(xù)仍選用10 g/L纖維二糖進行發(fā)酵實驗。

表3 E.coli P81(pUC19-bglB)利用不同濃度纖維二糖發(fā)酵乙醇Table 3 Ethanol fermentation of E.coli P81(pUC19-bglB) in LB medium with different concentration of cellobiose

為檢驗葡萄糖的存在對重組菌利用纖維二糖生產(chǎn)乙醇的影響，故進行葡萄糖和纖維二糖的共發(fā)酵實驗。重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)在含有10 g/L 葡萄糖和10 g/L 纖維二糖的LB中共發(fā)酵培養(yǎng)(圖6)，12 h 時，葡萄糖幾乎利用完全，纖維二糖只代謝了1.8 g/L，發(fā)酵48 h后殘余纖維二糖的濃度為5.9 g/L，代謝了4.1g/L纖維二糖，產(chǎn)生乙醇的濃度最高為3.4 g/L，達到了乙醇理論得率的46.5%。與含10 g/L 纖維二糖的LB 中發(fā)酵12 h 代謝3.2 g/L 纖維二糖這一結(jié)果相比，共發(fā)酵12 h 只代謝了1.8 g/L 纖維二糖，代謝速率下降近44%。分析由于葡萄糖、纖維二糖共發(fā)酵時，葡萄糖作為β-葡萄糖苷酶催化纖維二糖的產(chǎn)物，對β-葡萄糖苷酶形成了一定程度的反饋抑制，降低了催化效率。但菌體沒有出現(xiàn)二次生長的現(xiàn)象，葡萄糖并未對纖維二糖的利用形成葡萄糖遏制，實現(xiàn)了葡萄糖和纖維二糖同步代謝。

圖6 重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)的纖維二糖與葡萄糖共發(fā)酵Fig.6 Ethanol co-fermentation of E.coli P81(pUC19-bglB) in 10 g/L cellobiose and 10 g/L glucose.(×) for growth condition,(◇) for glucose concentration,(○) for cellobiose concentration,(△) for ethanol concentration.

本文對大腸桿菌進行一系列的基因工程改造，克隆了來自運動發(fā)酵單胞菌的高效乙醇生產(chǎn)路徑pdc-adhB，并置于啟動子Ptac的控制之下。啟動子Ptac是一個強啟動子，受到IPTG 誘導(dǎo)時，能加強基因的表達，從而一定程度上消除整合到基因組上導(dǎo)致的拷貝數(shù)降低而引起的表達降低。通過Red 重組將Ptac-pdc-adhB 整合到大腸桿菌JM109基因組的pflA、pflB 位點，在提高基因穩(wěn)定性的同時敲除了乙醇生產(chǎn)的競爭路徑。隨即轉(zhuǎn)入能夠分泌表達的β-葡萄糖苷酶bglB 基因，構(gòu)建得到可代謝纖維二糖進行乙醇發(fā)酵的CBP 重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)。

重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)發(fā)酵液中β-糖苷酶活可以達到3.62 mU/mL 菌液，周質(zhì)空間的β-糖苷酶活為81.16 mU/mL 菌液，總胞外β-糖苷酶活可以達到84.78 mU/mL 菌液，而發(fā)酵液中纖維二糖酶活可以達到0.80 mU/mL 菌液，周質(zhì)空間的纖維二糖酶活為31.54 mU/mL 菌液，總胞外纖維二糖酶活可以達到32.34 mU/mL 菌液，遠高于對照菌E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)的總胞外酶活。重組菌 E.coli P81(pUC19-bglB)在以纖維二糖為唯一碳源的M9中生長良好，48 h 代謝了2.5 g/L 的纖維二糖，但沒有乙醇產(chǎn)生。而在含10 g/L 纖維二糖的LB中發(fā)酵48 h 后，代謝了5.9 g/L 纖維二糖，產(chǎn)生1 g/L 乙醇，達到了乙醇理論得率的31.6%。在含30 g/L 纖維二糖的LB 發(fā)酵48 h 后，得到了最高的乙醇理論得率55.8%。重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)在含有10 g/L 葡萄糖和10 g/L 纖維二糖的LB 中進行共發(fā)酵培養(yǎng)，12 h 時，葡萄糖幾乎利用完全，發(fā)酵48 h 代謝了4.1 g/L 纖維二糖，產(chǎn)生乙醇的濃度最高為3.4 g/L，達到了乙醇理論得率的46.5%。

文中重組菌E.coli P81(pUC19-bglB)的胞外β-糖苷酶酶活雖高于對照菌E.coli JM109(pUC19)、E.coli P81(pUC19)，但β-葡萄糖苷酶的胞外量并不高，目前尚不具備在生物煉制過程中的實用價值，但本文的目的在于測試纖維素酶分泌表達型乙醇發(fā)酵整合生物加工細胞的概念是否可以實現(xiàn)。因此，選擇了蛋白分泌能力不強但容易進行基因工程操作的E.coli 作為模型微生物。結(jié)果表明，即使在較低的蛋白分泌條件下，纖維素酶分泌表達型乙醇發(fā)酵工程菌仍然表現(xiàn)出了明顯的整合生物加工能力，即同時進行纖維二糖的降解和乙醇發(fā)酵。

本文中由于沒有在發(fā)酵時控制pH 值，導(dǎo)致在發(fā)酵的后期β-葡萄糖苷酶的活性降低，所以在后續(xù)的實驗中考慮發(fā)酵培養(yǎng)時控制pH 值，并采取增加分泌的手段提高E.coli 的胞外酶活，提高β-葡萄糖苷酶的活性，增強對纖維二糖的代謝能力。此外僅單獨添加了3種纖維素酶中的一種，為了更高效地直接利用木質(zhì)纖維素，在后續(xù)的實驗中將研究與另外兩種纖維素酶的分泌共表達。

[1]Lynd LR,Laser MS,Bransby D,et al.How biotech can transform biofuels.Nat Biotechnol,2008,26(2):169?172.

[2]Zhang XZ,Zhang YH.One-step production of biocommodities from lignocellulosic biomass by recombinant.Eng Life Sci,2010,10(5):398?406.

[3]Hasunuma T,Kondo A.Development of yeast cell factories for consolidated bioprocessing of lignocellulose to bioethanol through cell surface engineering.Biotechnol Adv,2012,30(6):1207?1218.

[4]Wen F,Sun J,Zhao HM.Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol.Appl Environ Microbiol,2010,76(4):1251?1260.

[5]Sun J,Wen F,Si T,et al.Direct conversion of xylan to ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae strains displaying an engineered minihemicellulosome.Appl Environ Microbiol,2012,78(11):3837?3845.

[6]Tokuhiro K,Ishida N,Kondo A,et al.Lactic fermentation of cellobiose by a yeast strain displaying beta-glucosidase on the cell surface.Appl Microbiol Biotechnol,2008,79(3):481?488.

[7]Kotaka A,Bando H,Kaya M,et al.Direct ethanol production from barley beta-glucan by sake yeast displaying Aspergillus oryzae beta-glucosidase and endoglucanase.J Biosci Bioeng,2008,105(6):622?627.

[8]Ryu S,Karim MN.A whole cell biocatalyst for cellulosic ethanol production from dilute acid-pretreated corn stover hydrolyzates.Appl Microbiol Biotechnol,2011,91(3):529?542.

[9]Xu LL,Shen Y,Bao XM.Progress and strategies on bioethanol production from lignocellulose by consolidated bioprocessing(CBP)using Saccharomyces cerevisiae.Chin J Biotech,2010,26(7):870?879(in Chinese).徐麗麗,沈煜,鮑曉明.釀酒酵母纖維素乙醇統(tǒng)合加工(CBP)的策略及研究進展.生物工程學(xué)報,2010,26(7):870?879.

[10]Petrenko V.Evolution of phage display:from bioactive peptides to bioselective nanomaterials.Expert Opin Drug Deliv,2008,5(8):825?836.

[11]Kondo A,Ueda M.Yeast cell-surface display-applications of molecular display.Appl Microbiol Biotechnol,2004,64(1):28?40.

[12]Yukti B,Saroj M,Bisaria VS.Microbial β-glucosidases:cloning,properties,and applications.Crit Rev Biotechnol,2002,22(4):375?407.

[13]Shewale JG.β-glucosidase:its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose.Int J Biochem,1982,14(6):435?443.

[14]Zhao Y,Liu WF,Mao AJ,et al.Expression,purification and characterization of gene β-glucosidase in Escherichia coli from Bacillus polymyxa.Chin J Biotech,2004,20(5):741?744(in Chinese).趙云,劉偉豐,毛愛軍,等.多粘芽胞桿菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的表達、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析.生物工程學(xué)報,2004,20(5):741?744.

[15]Yuan XH.Optimization of β-glucosidase producing strains and culture conditions,and the applied research appliciation of β-glucosidase [D].Shandong:Shandong University,2009(in Chinese).袁曉華.β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化及β-葡萄糖苷酶應(yīng)用研究[D].山東:山東大學(xué),2009.

[16]Chen JN,Zhang W,Li T,et al.Optimization of metabolic pathways for bioconversion of lignocellulose to ethanol through genetic engineering.Biotechnol Adv,2009,27(5):593?598.

[17]Kirill AD,Barry LW.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640?6645.

[18]Zhang X,Wen TY.Progress of Red recombination system for E.coli gene modification.China Biotechnol,2008,28(12):89?93(in Chinese).張雪,溫廷益.Red 重組系統(tǒng)用于大腸桿菌基因修飾研究進展.中國生物工程雜志,2008,28(12):89?93.

[19]Cherepanov PP,Wackernagel W.Gene disruption in Escherichia coli:TcRand KmRcassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.Gene,1995,158(1):9?14.

[20]Chen YC,Chen LA ,Chen SJ,et al.A modified osmotic shock for periplasmic release of a recombinant creatinase from Escherichia coli.Biochem Eng J,2004,19(3):211?215.

[21]Yanase H,Yamamoto K,Sato D,et al.Ethanol production from cellobiose by Zymobacter palmae carrying the Ruminocuccus albus β-glucosidase gene.J Biotechnol,2005,118(1):35?43.

[22]Wang Y.Cloning and co-expression of genes heat-resistant endoglucanase and β-glucosidase in Bacillus subtilis[D].Shanghai:East China University Science Technology,2012(in Chinese).王遠.耐熱內(nèi)切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中的共表達[D].上海:華東理工大學(xué),2012.

[23]Gonzalez-candelas L,Aristoy MC,Polaina J,et al.Cloning and characterization of two genes from Bacillus polymyxa expressing β-glucosidase activity in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol,1989,55(12):3173?3177.

[24]Wang Z,Chen M,Xu Y.An ethanol-tolerant recombinant Escherichia coli expressing Zymomonas mobiles pdc and adhB genes for enhanced ethanol production from xylose.Biotechnol Lett,2008,30(4):657?663.