微生物發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸研究進(jìn)展

康振，張俊麗，楊森，堵國成，陳堅(jiān)

1 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122

3 江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122

4 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是一種非蛋白類的5碳氨基酸，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物以及動(dòng)物中。在生物體內(nèi)，5-ALA 是合成吡咯類化合物(如血紅素、細(xì)胞色素、葉綠素以及維生素B12)的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物。近年來，5-ALA 作為一種安全、選擇、滲透性好的光動(dòng)力學(xué)藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。目前，5-ALA 已經(jīng)應(yīng)用于諸多癌癥(如皮膚癌、膀胱癌、消化道癌及肺癌等)的診斷與光動(dòng)力治療(PDT)中[1]。此外，由于5-ALA 在環(huán)境中易降解，無殘留，對(duì)哺乳動(dòng)物無毒性，因此，5-ALA在農(nóng)業(yè)上具有重要的應(yīng)用前景(如作為一種無公害的綠色農(nóng)藥、除草劑以及植物生長調(diào)節(jié)劑)[1-2]。

目前，5-ALA 主要通過化學(xué)法合成[3]，然而由于化學(xué)合成反應(yīng)步驟多、副產(chǎn)物多、分離提純難、5-ALA 的得率低以及環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，生物法合成5-ALA 成為未來研究發(fā)展的趨勢[1]。自然界中，5-ALA 的合成存在兩條途徑[1]，一條是C4途徑(因4碳的琥珀酸而得名[4])，另一條是C5途徑(因5碳的谷氨酸而得名[5])。前者較為簡單，由5-氨基乙酰丙酸合酶(5-aminolevulic acid synthase,ALAS)催化琥珀酰CoA 和甘氨酸生成5-ALA，該途徑主要存在于光合細(xì)菌(如紫細(xì)菌屬等)、真菌以及動(dòng)物體中；后者由谷氨酸起始經(jīng)過三步酶促反應(yīng)生成5-ALA[1]，該途徑廣泛存在于植物、藻類以及細(xì)菌中(如腸桿菌屬等)。隨著基因重組技術(shù)、代謝工程以及合成生物學(xué)的發(fā)展，構(gòu)建性狀優(yōu)良的微生物工程菌株從而實(shí)現(xiàn)5-ALA 的微生物法合成已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。

1 自然界5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)微生物的篩選、誘變以及培養(yǎng)優(yōu)化

早期，微生物合成5-ALA 的相關(guān)研究主要集中于從自然界中篩選5-ALA 的生產(chǎn)菌株。1970年，Beale 等[6]篩選到一株小球藻Chlorella vulgaris，研究發(fā)現(xiàn)C.vulgaris 可以利用CO2積累5-ALA，隨后其他不同小球藻也被報(bào)道具有合成積累5-ALA 的能力[7-8]。然而，由于微藻類積累5-ALA 的濃度及應(yīng)用價(jià)值較低，后來篩選工作主要集中于從自然界中篩選生產(chǎn)5-ALA 的光合細(xì)菌。1987年，Sasaki 等[9]篩選到一株類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides，通過人為添加5-ALA 的兩個(gè)前體物琥珀酸和甘氨酸，5-ALA 積累到2.0 mmol/L，隨后進(jìn)一步添加乙酸和丙酸，5-ALA 產(chǎn)量提高至4.2 mmol/L[10](表1)。在獲得優(yōu)良的母本菌株后，為進(jìn)一步提高R.sphaeroides 菌株的生產(chǎn)性能，研究者采用亞硝基胍(1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin)等誘變劑對(duì)菌株R.sphaeroides 進(jìn)行多輪誘變，5-ALA 的產(chǎn)量得到顯著提高[1](表1)。

在生物體內(nèi)，5-ALA 可以通過5-ALA 脫水酶(HemB，由hemB 基因編碼)的催化轉(zhuǎn)化為膽色素原(Porphobilinogen)。研究發(fā)現(xiàn)乙酰丙酸(Levulinic acid)是5-ALA 脫水酶的競爭性抑制劑，因此，人為添加適量的乙酰丙酸抑制5-ALA脫水酶的活性以積累5-ALA 成為發(fā)酵優(yōu)化中的一個(gè)策略[11]。另一方面，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，突變菌株R.sphaeroides CR720積累5-ALA 達(dá)到27.5 mmol/L[12]。但由于光合細(xì)菌發(fā)酵周期長、且發(fā)酵過程需要光照，使得發(fā)酵成本高，因而不適合大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

2 微生物全細(xì)胞催化合成5-氨基乙酰丙酸

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，采用模式微生物表達(dá)異源蛋白基因，實(shí)現(xiàn)酶的活性表達(dá)或者構(gòu)建新的代謝途徑已經(jīng)獲得飛速發(fā)展。大腸桿菌Escherichia coli 這一模式微生物由于其諸多優(yōu)點(diǎn)(如遺傳背景清晰、遺傳操作工具完善、操作簡單、營養(yǎng)要求簡單等)而受到研究者的青睞。1993年，Neidle 等[13-14]從R.sphaeroides 菌株中成功克隆編碼ALAS 的兩個(gè)同工酶基因hemA和hemT。研究發(fā)現(xiàn)，在R.sphaeroides 菌株中，hemA 基因發(fā)揮主要功能。隨后，van der Werf等[15]成功將來源于 R.sphaeroides 菌株中的hemA 基因克隆至E.coli，實(shí)現(xiàn)了hemA 基因的活性表達(dá)以及5-ALA 的異源生物轉(zhuǎn)化。通過ALAS 的酶學(xué)性質(zhì)研究以及添加5-ALA 前體物甘氨酸、琥珀酸以及ATP，5-ALA 產(chǎn)量提高到22.0 mmol/L (表1)。

在基于C4途徑的全細(xì)胞催化中(圖1)，ALAS 發(fā)揮著最重要的作用，提高ALAS 的活力是實(shí)現(xiàn)5-ALA 高產(chǎn)的關(guān)鍵。2003年，Xie 等[16]考察了初始琥珀酸和葡萄糖濃度以及IPTG 誘導(dǎo)濃度對(duì)來源于R.sphaeroides 菌株的hemA 基因編碼的ALAS 的酶活力的影響，并且通過優(yōu)化培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)ALAS 的最大活力，5-ALA 產(chǎn)量提高至39.0 mmol/L (表1)?；谔岣逜LAS 的表達(dá)及活力，F(xiàn)u 等將來源于R.sphaeroides 的hemA基因克隆至依賴于T7聚合酶的表達(dá)系統(tǒng)，并分析了E.coli BL21(DE3)和 Rosetta (DE3)(可優(yōu)化表達(dá)稀有密碼子的菌株)的表達(dá)差異。研究發(fā)現(xiàn)，hemA 基因在Rosetta (DE3)菌株中實(shí)現(xiàn)了更好的表達(dá)，5-ALA 產(chǎn)量提高至29.0 mmol/L[17](表1)。同時(shí)，不同課題組分別從大豆根瘤菌Bradyrhzobium japonicum[18-19]、放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter[20-22]、沼澤紅假單胞菌 Rhodopseudomonas palustris[23]菌株中克隆hemA 基因并在E.coli 中進(jìn)行表達(dá)分析(表1)。研究表明，不同來源的ALAS 在E.coli 中的活性差異較大。Shin 等[24]發(fā)現(xiàn)通過共表達(dá)依賴于NADPH 的蘋果酸酶基因maeB，ALAS 的活性得到顯著提高，最終引起5-ALA 的高效積累，這表明5-ALA 的合成可能與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電勢具有密切的關(guān)系。

在生物體內(nèi)，5-ALA 的合成是吡咯類化合物合成的限速步驟，它的合成受到嚴(yán)格的調(diào)控(ALAS 受血紅素的反饋抑制)?；诖?，最近Zhang 等[25]從R.palustris 中克隆了ALAS 的兩個(gè)同工酶基因hemA 和hemO，研究發(fā)現(xiàn)由hemO基因編碼的ALAS 具有較高的抗反饋抑制能力(hemin)，最終通過表達(dá)基因hemO，5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到48.1 mmol/L (表1)。

圖1 大腸桿菌中重組5-氨基乙酰丙酸C4合成途徑Fig.1 Recombinant C4 pathway engineered for 5-aminolevulinic acid biosynthesis in E.coli.PGD:3-phosphoglycerate dehydrogenase;ODH:2-oxoglutarate dehydrogenase;SCS:succinyl-CoA synthetase;SDH:succinate dehydrogenase;PHTA:phosphoserine aminotransferase;SHMT:serine hydroxymethyltransferase;ALAS:5-aminolevulinic acid synthase.The bold line means the genes need to be overexpressed for increasing ALA production.? indicates the reaction needs to be blocked.During biotransformation,glucose,succinate and glycine as substrates were added.

此外，研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，當(dāng)甘氨酸濃度大于23.0 mmol/L 時(shí)，菌體生長受到顯著抑制[15]。另外，最近研究表明，葡萄糖以及木糖對(duì)5-ALA 脫水酶的活性均有一定的抑制作用[22]。因此，為進(jìn)一步提高5-ALA 的產(chǎn)量，發(fā)酵過程優(yōu)化控制顯得尤為重要。Fu 等[26]通過控制流加發(fā)酵液的pH，5-ALA 產(chǎn)量提高至50.4 mmol/L (表1)。隨后，Lin 等[27]通過優(yōu)化發(fā)酵碳源以及控制發(fā)酵pH，5-ALA 產(chǎn)量提高至56.0 mmol/L (表1)。

3 代謝工程改造微生物合成5-氨基乙酰丙酸

目前，基于C4途徑的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成5-ALA 得到了長足發(fā)展。但研究報(bào)道中所用培養(yǎng)基多為營養(yǎng)豐富、實(shí)驗(yàn)室用的LB 培養(yǎng)基，不利于5-ALA 的工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，甘氨酸對(duì)菌體的生長抑制作用使得發(fā)酵工藝相對(duì)復(fù)雜。因此，構(gòu)建直接發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)5-ALA 的微生物菌株具有更大優(yōu)勢。近年來，代謝工程作為一個(gè)強(qiáng)大的工具已經(jīng)成功應(yīng)用于微生物代謝的調(diào)控及工程菌株的構(gòu)建中[28]。

最近，Kang 等[29]將來源于R.sphaeroides編碼ALAS 的基因hemA 分別克隆至野生型的E.coli MG1655菌株以及好氧琥珀酸發(fā)酵菌株E.coli QZ1111[30]中，并進(jìn)行比較分析。研究發(fā)現(xiàn)，野生型的E.coli 在表達(dá)ALAS 后，以葡萄糖(111.1 mmol/L)為唯一碳源積累5-ALA 至0.6 mmol/L。而相同條件下好氧琥珀酸發(fā)酵菌株中5-ALA 產(chǎn)量為3.3 mmol/L (表1)。以上研究結(jié)果表明，通過對(duì)5-ALA 的C4相關(guān)途徑改造(圖1)，可以實(shí)現(xiàn)一步法發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)5-ALA。此外，通過對(duì)表達(dá)hemA 的好氧琥珀酸發(fā)酵菌株的代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，琥珀酸由于過量而分泌到胞外。以上結(jié)果表明，為提高5-ALA 的高效合成，通過進(jìn)一步代謝途徑改造實(shí)現(xiàn)甘氨酸的積累是非常必要的，如解除絲氨酸對(duì)3-磷酸甘油酸脫氫酶的反饋抑制(圖1)。

此外，Kang 等[31]首次通過改造 E.coli 5-ALA 的C5途徑(圖2)，實(shí)現(xiàn)了在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中一步發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)5-ALA 的設(shè)想。

圖2 大腸桿菌中重組5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑[31]Fig.2 Recombinant C5 pathway engineered for 5-aminolevulinic acid biosynthesis in E.coli[31].PDH:pyruvate dehydrogenase;GS:glutamate dehydrogenase;GluS:glutamyl-tRNA synthetase;GluTR:glutamyl-tRNA reductase;GSA-AM:glutamate-1-semialdehyde aminotransferase.

通過研究發(fā)現(xiàn)，由hemA 基因編碼的谷氨酰-tRNA 還原酶以及由hemL 基因編碼的谷氨酸-1半醛氨基轉(zhuǎn)移酶是C5途徑的限速酶，二者存在協(xié)同作用。通過單獨(dú)表達(dá)hemA 突變體基因以及共表達(dá)hemA 突變體基因和hemL 基因，5-ALA產(chǎn)量分別提高了5.7倍(1.3 mmol/L)和66倍(15.5 mmol/L)(對(duì)照菌株為轉(zhuǎn)化空載體的野生型E.coli)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，由gltX 基因編碼的谷氨酰-tRNA 合成酶對(duì)C5途徑中的編碼5-ALA 脫水酶的hemB 基因存在上調(diào)作用。

在E.coli 中，許多潛在的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)被鑒定出來[32]，并成功應(yīng)用于氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)[33]。因此，為加速5-ALA 的胞外分泌，研究者對(duì)5-ALA 相關(guān)潛在的運(yùn)輸?shù)鞍纵d體YeaS[34](亮氨酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由yeaS 基因編碼)以及RhtA[35](蘇氨酸和高絲氨酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由rhtA 基因編碼)進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)RhtA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)5-ALA 具有較強(qiáng)的運(yùn)輸能力，通過共表達(dá)rhtA 基因，胞外5-ALA 的產(chǎn)量提高了約46%(22.6 mmol/L)(對(duì)照菌株是共表達(dá)hemA 突變體和hemL 的E.coli)。最終，在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(嚴(yán)格控制Fe2+濃度)的基礎(chǔ)上通過分批發(fā)酵，5-ALA 濃度最終為31.5 mmol/L(表1)(5-ALA/葡萄糖轉(zhuǎn)化率為16.8%)[31]。

表1 微生物發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸Table 1 Microbial production of 5-aminolevulinic acid

4 展望

在過去幾年里，5-ALA 的微生物合成取得了巨大進(jìn)步，實(shí)現(xiàn)微生物高效合成5-ALA 已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)?；趯?shí)現(xiàn)5-ALA 的微生物法工業(yè)化生產(chǎn)，相關(guān)研究將主要集中于以下幾個(gè)方面：1)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法合成5-ALA：在該過程中，ALAS 的高活力以及抗血紅素的反饋抑制是提高5-ALA 合成的關(guān)鍵。以往研究多集中于從自然界不同宿主中調(diào)取ALAS 的同工酶基因，并對(duì)其分析比較。隨著酶工程的發(fā)展，理性改造技術(shù)(借助于生物信息學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)的定點(diǎn)突變以及飽和迭代突變等[36])以及非理性改造技術(shù)(借助error-prone PCR、DNA shuffling 等[37])已經(jīng)廣泛應(yīng)用于酶分子改造。因此，借助以上技術(shù)實(shí)現(xiàn)ALAS 的分子改造已成為可能。另外，加速5-ALA 的胞外運(yùn)輸也是研究的一個(gè)方向。2)代謝工程改造微生物實(shí)現(xiàn)葡萄糖一步發(fā)酵合成5-ALA：目前，基于對(duì)C4途徑和C5途徑的改造，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中一步發(fā)酵葡萄糖合成5-ALA已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。但由于生物體內(nèi)5-ALA 的合成調(diào)控極其復(fù)雜，為進(jìn)一步提高5-ALA 的合成效率，未來相關(guān)研究可借助系統(tǒng)生物學(xué)手段[38]從基因組水平對(duì)5-ALA 的合成途徑進(jìn)行系統(tǒng)分析，同時(shí)利用合成生物學(xué)等調(diào)控元件和策略[39-40]實(shí)現(xiàn)5-ALA 合成途徑中的關(guān)鍵基因的精細(xì)調(diào)控表達(dá)[41]以及對(duì)工程菌株發(fā)酵過程各參數(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為碳源高效合成5-ALA的工業(yè)化生產(chǎn)。

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