賁門癌組織中Midkine蛋白的表達及其臨床意義

呼秀峰 姚 俊 馮笑山* 茹 藝 劉 剛

（河南科技大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，河南 洛陽 471003）

賁門癌組織中Midkine蛋白的表達及其臨床意義

呼秀峰 姚 俊 馮笑山* 茹 藝 劉 剛

（河南科技大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，河南 洛陽 471003）

目的 檢測賁門癌組織中 Midkine 蛋白表達情況，探討 Midkine 蛋白與賁門癌生物學行為的關系及意義。方法 采用免疫組織化學SP 法檢測 Midkine 蛋白在正常賁門黏膜、賁門不典型增生組織、賁門癌組織中的表達情況，將檢測結果與賁門癌臨床病理資料進行統(tǒng)計學分析，并對所有病例進行隨訪，探討其與賁門癌預后的關系。結果 Midkine 蛋白在賁門癌中表達上調(diào)，且表達率（76.4%）顯著高于賁門不典型增生組織（26.9%）及正常賁門黏膜（5%），其表達強度與患者年齡、性別、腫塊大小、組織分化程度無關（P ＞ 0.05），而與浸潤深度、淋巴結轉移及預后正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。結論 Midkine 蛋白高表達顯示賁門癌惡性程度高、分期晚、預后不良 ; Midkine 蛋白在賁門癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

賁門腫瘤；Midkine 蛋白；免疫組織化學；預后

賁門腺癌（Gastric cardiac adenocinoma GCA）是上端胃臨近食管部位發(fā)生的腺癌，流行病學調(diào)查顯示其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是增長速度最快的惡性腫瘤之一[1]。近年來賁門癌的診斷及治療方面取得較大進展，但由于缺乏敏感、特異的早期診斷指標，所以賁門癌仍是預后差，病死率相當高的惡性腫瘤之一。Midkine蛋白（MK）是一種肝素結合性生長因子，通過促細胞增殖及血管生成、誘導細胞惡性轉化、抗凋亡等功能影響惡性腫瘤細胞的生長增殖、分化凋亡，與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。研究顯示，Midkine蛋白在肝癌、胃癌、結直腸癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)母細胞瘤等許多惡性腫瘤中過表達，并與腫瘤浸潤及預后密切相關[2]，但MK在賁門癌中的表達尚未見報道。本研究采用免疫組織化學方法（SP法）對賁門癌組織中Midkine蛋白表達情況進行檢測，分析其在賁門癌中的表達及與臨床病理的關系，探討其在賁門癌發(fā)生發(fā)展及侵襲、轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

72例賁門癌均取自2007年～2009年河南科技大學第一附屬醫(yī)院病理科手術切除后經(jīng)病理診斷明確的存檔蠟塊。其中賁門癌組織72例，男56例，女16例，平均年齡（55.4±7.56）歲。癌旁不典型增生組織26例，男17例，女9例，平均年齡（54.2±7.9）歲。距癌組織10cm以上癌旁正常組織40例，男28例，女12例，平均年齡（55.3±8.3）歲。患者術前均未接受放療和化療。

1.2 主要試劑

兔抗人Midkine蛋白多克隆抗體購自SantaCruz公司，抗兔及抗鼠SP超敏試劑盒、DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。

1.3 方法

將原石蠟包埋的蠟塊作4μm切片，每例作連續(xù)切片5張，分別作HE染色、Midkine蛋白和syndecan-1免疫組織化學SP法染色，2片備用。各組織切片常規(guī)脫蠟及水化后，依次按說明書完成免疫組化染色各步驟。用已知陽性對照片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷

陽性結果判斷標準：Midkine蛋白陽性染色定位于細胞膜和（或）細胞質(zhì)內(nèi)。凡細胞質(zhì)和/或細胞膜出現(xiàn)清晰的棕黃色染色的細胞即為陽性細胞。先在低倍鏡下觀察，隨機讀取5個高倍視野下的陽性細胞數(shù)。并將陽性細胞計數(shù)分為四個等級，分別為：無陽性細胞計0分，≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。并將著色強度分為三個等級分別為：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最后將兩項評分相乘，得出結果并分為四個等級：0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中度陽性（++），大于4分則為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包作統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，生存分析應用單變量Log-rank檢驗。

2 結 果

2.1 MK的表達

MK在正常賁門黏膜組織中多呈陰性表達，少部分為弱陽性，陽性率為5.0%。MK在賁門癌組織中的表達呈細胞漿或膜分布，陽性信號為棕黃色顆粒，陽性率為76.4%（55/72），顯著高于在賁門不典型增生組織及賁門正常組織中的表達，三者相比結果具有明顯差異（P＜0.01）（表1）。

表1 不同賁門黏膜組織中Midkine蛋白的表達

2.2 Midkine蛋白表達與賁門癌臨床病理學特征關系

72例賁門癌中MK的陽性表達表達率為76.4%。MK的表達與TNM分期（χ2=12.231，P＜0.05）、有無淋巴結轉移（χ2=8.50，P＜0.05）及漿膜浸潤（χ2=5.073，P＜0.01）顯著相關，差異有統(tǒng)計學意義；其表達與患者年齡、性別、腫塊大小、組織分化程度無關（P＞0.05）（表2）。

2.3 賁門癌組織中Midkine蛋白表達與預后的關系

本組患者隨訪時間為48個月，72例賁門癌患者中，Midkine蛋白陽性表達患者中位生存時間為27.0個月，3年生存率為37.5%。Midkine蛋白陰性表達組的中位生存時間及3年生存率均高于Midkine蛋白陽性表達組（P=0.029）。經(jīng)檢驗Midkine蛋白與患者預后相關，即Midkine蛋白陰性患者總體生存期長，見。

3 討 論

表2 Midkine蛋白表達與GCA臨床病理學特征關系

賁門癌是一種在胃賁門部發(fā)生的惡性腫瘤，是我國北方地區(qū)常見的消化道惡性腫瘤之一，流行病學調(diào)查顯示其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是增長速度最快的惡性腫瘤之一[3]。在西方國家，隨著遠側部胃癌發(fā)病率的逐年下降[4，5]，賁門腺癌的發(fā)病率已接近全部胃癌的50%[6]。流行病學和人群研究提示，賁門癌的誘發(fā)因素、病理特征、以及臨床特征與胃遠側部位腫瘤明顯不同[7]。腫瘤侵襲、轉移的機制很復雜，是多階段、多步驟、多因素、多基因的發(fā)展過程，近年來雖然賁門癌在診斷與綜合治療方面取得較大進展，腫瘤切除率和生存率有所提高，但由于早期癥狀不典型，加之缺乏敏感、特異的早期診斷指標，大多數(shù)患者就診時已為中晚期，綜合治療后的五年生存率不超過24%[8]，因此深入研究賁門癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移機制，對于診斷及制定合理治療方案，具有重要的理論意義和臨床價值。

Midkine蛋白（MK）即肝素結合生長因子。1988年，Kadomatsu等人通過差異雜交方法在小鼠胚胎腫瘤細胞（HM-1）中發(fā)現(xiàn)的一種新基因，并報道其在胚胎性癌細胞分化早期強烈表達[9]。人類MK基因（MDK）定位于11P11.2上，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。其編碼蛋白質(zhì)分子量為13-kDa，富含堿性氨基酸和半胱氨酸[10]。目前已發(fā)現(xiàn)的MK受體包括syndecan家族成員、蛋白多糖受體型酪氨酸激酶、低密度脂蛋白（LDL）、受體相關的蛋白（LRP）以及間變性淋巴瘤激酶（ALK）等[11]。研究顯示MK具有多種生物學功能，與多種疾病的發(fā)病有關，然而MK最引人注目的特點是其在癌癥晚期頻繁并且強烈表達[2]。MK在癌變過程中顯示腫瘤的相關活性，包括轉化、纖維蛋白溶解、細胞轉移、細胞存活、抗凋亡等作用，但是到目前為止，MK促進腫瘤生長的確切的作用機制尚不清楚[12]。研究顯示MK在許多惡性腫瘤如食管癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、wilms瘤、神經(jīng)母細胞瘤及硬脊膜瘤中高頻率、高強度表達，并與腫瘤發(fā)展進程及嚴重程度密切相關[13]。Obata等[14]報道，胃賁門癌患者血清中MK含量顯著提高，而且晚期癌的血清MK含量高于早期瘤。趙志國等[15]報道胃賁門癌組織中MK表達陽性率達76.6%，其表達水平與胃賁門癌的浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期及微血管密度密切相關，與患者年齡、腫瘤的大小、性別，胃賁門癌分化程度無關，患者血清中MK水平亦明顯高于正常人。然而，MK在賁門癌中的表達尚未見報道。本研究顯示，在72例賁門癌患者中有55例Midkine蛋白過度表達，陽性率為76.4%。賁門癌組織中Midkine蛋白的陽性表達顯著高于癌旁正常組織（χ2=52.437，P＜0.01），與文獻報告的胃癌Midkine蛋白表達率一般在65%～80%相仿，（III+Ⅳ）期賁門癌組織中MK陽性表達率顯著高于（I+II）期（χ2=12.630，P＜0.05），有淋巴結轉移組MK陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移組（χ2=8.5，P＜0.05）。有漿膜浸潤組MK陽性表達率高于無漿膜浸潤組（χ2=5.073，P＜0.01）。結果顯示Midkine蛋白過表達患者往往分期較晚，預后較差，提示Midkine蛋白可能促進腫瘤細胞增殖、浸潤及轉移。研究未能發(fā)現(xiàn)MK表達與年齡、性別及腫瘤細胞分化程度的相關性。

由于MK受體種類繁多，多種受體可能單獨或聯(lián)合調(diào)節(jié)MK生物活性，這些受體之間的相互作用及復合物組成的詳細情況尚未見確切報道，所以目前還不清楚它們之間通過怎樣的機制相互作用，值得我們進一步研究。綜合本實驗結果認為MK可能與胃賁門癌的發(fā)生、發(fā)展有關，并能反映出胃賁門癌組織的惡性程度及侵襲能力，提示可作為胃賁門癌早期診斷及預后分析的指標之一，在臨床診斷及指導術后治療方面有一定價值。

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R735.2

：B

：1671-8194（2013）10-0083-03

洛陽市新技術研發(fā)計劃項目（編號：NO.1002238B）

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