枯草芽孢桿菌和黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽 的工藝條件優(yōu)化

劉瀟，郭麗娜，馬海樂，王珂，吳平，洪晨，趙興，張成

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）（2.中儲糧鎮(zhèn)江糧油有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

核桃又名胡桃、羌桃，屬胡桃科胡桃屬植物，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界四大干果。我國有著豐 富的核桃資源，其產(chǎn)量更是超過世界核桃總產(chǎn)量的50%以上。核桃富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)以及多種活性物質(zhì)[1]。核桃不僅可作為油脂的來源，同時還能作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。核桃粕是核桃經(jīng)去殼后，將核桃仁壓榨取油后所得到的塊狀或粉狀副產(chǎn)品，其中核桃蛋白質(zhì)含量占核桃粕干重30%～70%[2]。核桃蛋白中18種氨基酸含量比例平衡，尤其是對人體有重要功能的谷氨酸、天門氨酸、精氨酸含量較高[3]。作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源，企業(yè)往往將核桃粕作為飼料原料或廢棄物進行處理，將其制備成核桃粕多肽能極大提高對核桃蛋白的利用，有效增加核桃粕的附加值。核桃多肽是以核桃粕為原料，通過生化反應(yīng)將大分子蛋白降解為小分子肽混合物，其具有一定生物活性。有研究表明核桃多肽對超氧陰離子自由基、羥基自由基以及 DPPH 自由基有一定清除作用[4～6]。目前以蛋白質(zhì)為原料制備多肽的方法主要有酶水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)水解法[7]。微生物發(fā)酵因微生物能利用原料中多種營養(yǎng)物質(zhì)、原料無需進行蛋白提取等優(yōu)點成為研究的熱門。

固態(tài)發(fā)酵相比液態(tài)發(fā)酵具有原料處理簡單、技術(shù)簡單、投資少、能源消耗低、后期處理簡單、發(fā)酵粗放不易雜染菌等優(yōu)點[8]。目前，關(guān)于核桃粕的研究主要集中在液態(tài)發(fā)酵制備多肽、核桃多肽功能評價及應(yīng)用、發(fā)酵制備核桃蛋白飲料等方面，所涉及的菌種多為黑曲霉，其他菌種尤其是細(xì)菌的研究還較少，因此本研究旨在通過對枯草芽孢桿菌和黑曲霉的生產(chǎn)性能比對研究，進一步豐富核桃粕固態(tài)發(fā)酵用菌種，進一步提高核桃多肽的產(chǎn)量，提供更高效的固態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽的方法。本研究采取固態(tài)發(fā)酵的方法，采用單因素優(yōu)化法篩選固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)條件，以多肽最終得率作為評價指標(biāo)進行枯草芽孢桿菌和和黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備核桃粕多肽的效果研究，為工業(yè)化生產(chǎn)以及核桃副產(chǎn)物資源有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕（產(chǎn)于遼寧本溪桓仁東北野生山核），遼寧長白仙子生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌10160，本實驗室留存；黑曲霉GIM3.452，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；還原型谷胱甘肽、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯均為生物試劑；其他試劑均為分析純，購置于國藥集團。

1.2 實驗儀器與設(shè)備

BS124S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YM30Z型滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；JJ-CJ-2FD型雙人單面超凈臺，蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司；PHS-25型數(shù)顯式PH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-5臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HJ-4型多頭磁力攪拌器，上海中大儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃粕成分測定

蛋白含量測定：凱氏定氮GB 5009.5-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定；

脂肪測定：索氏提取GB 5009.6-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定；

灰分測定：GB 5009.4-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定；

淀粉含量測定：GB 5009.9-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測定；

水分測定：GB 5009.3-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定。

1.3.2 菌種活化及種子液制備

將所購黑曲霉按菌種說明接種到斜面培養(yǎng)基上活化，在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至孢子成熟后，用無菌生理鹽水將孢子洗下接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，使用前，取孢子成熟的PDA培養(yǎng)皿，用少量無菌水將孢子洗下，用血球計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)節(jié)孢子濃度至 108cfu/mL[9]。

實驗室保存的枯草芽孢桿菌接種在固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置活化48 h，隨后，用接種環(huán)挑取2環(huán)菌體接入100 mL已滅菌的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)24 h。取活化后的液體培養(yǎng)基1 mL接入100 mL液體培養(yǎng)基三角瓶內(nèi)用進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速 180 r/min，培養(yǎng) 12 h，得到發(fā)酵種子液，用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋并調(diào)節(jié)菌液濃度至 107cfu/mL。該發(fā)酵種子液應(yīng)于當(dāng)內(nèi)一次用完。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵

核桃粕經(jīng)粉碎后過40目篩，準(zhǔn)備若干250 mL燒杯，每個燒杯裝 40.00 g 核桃粕，121 ℃滅菌 20 min，滅菌后無菌操作添加無菌水。按接種量（5、10、15和20%）接入發(fā)酵種子液，玻璃棒攪拌混勻，用紗布封口，在實驗設(shè)計條件下進行發(fā)酵。發(fā)酵完畢后，將樣品取出，于55 ℃烘箱干燥48 h，粉碎過40目篩備用[10]。

發(fā)酵條件優(yōu)化，參照文獻[11]進行影響因素優(yōu)化。首先以發(fā)酵時間（0、1、2、3、4、5、6、7、8和9 d）為單一研究參數(shù)，研究最佳發(fā)酵時間參數(shù)，在確定發(fā)酵時間后，依次研究原料粉碎粒徑（不粉碎、20、40和60目）、發(fā)酵溫度（28、31、34和37 ℃）、接種量（5、10、15和20%）、料液比（1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25）對發(fā)酵制備核桃多肽的影響，以多肽產(chǎn)量為指標(biāo)，進行試驗。

1.3.4 多肽含量的測定采用雙縮脲法測定核桃多肽濃度[12,13]

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：將還原型谷胱甘肽用體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸以此配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入4.0 mL雙縮脲試劑，混勻靜置 10 min 后，4000 r/min 離心 10 min，取上清液在540 nm波長處測定吸光度，重復(fù)上述步驟以6 mL 5%三氯乙酸與4 mL雙縮脲試劑反應(yīng)后的溶液為空白進行調(diào)零。

樣品多肽的測定：準(zhǔn)確稱取2 g發(fā)酵后干燥的樣品（精確至0.0001 g），加40 mL蒸餾水，磁力攪拌30 min，取 8 mL 上清液于 4000 r/min 離心 10 min，取4 mL離心后上清液加入4 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻靜置 10 min，繼續(xù)以 4000 r/min 離心 10 min，將離心后上清液全部轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，用5%的三氯乙酸定容，取6.0 mL樣液加入4.0 mL雙縮脲試劑，混勻靜置 10 min，然后 4000 r/min 離心 10 min，取上清液在540 nm波長處測定OD值[14]。多肽含量按照以下公式計算：

式中：c為上清液中多肽的質(zhì)量濃度，mg/mL；v溶解樣品提取多肽所用蒸餾水體積，mL；m為原料發(fā)酵后稱取測定樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 分子量分布采用高效凝膠過濾色譜法測定多肽的分子量分布[15]

樣品制備：樣品經(jīng)干燥后，粉碎，準(zhǔn)確稱取 2 g樣品（精確至0.0001 g），加20 mL蒸餾水，磁力攪拌30 min，取 5 mL 上清液 4000 r/min 離心 10 min，取 1 mL過0.22 μm水系膜，留作分子量測定用。

色譜柱：TSK gel G2000（300 mm×7.8 mm）流動相的組成為：乙腈:水:三氟乙酸=45:5:0.1，洗脫流速：0.5 mL/min，檢測波長：220 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。液相系統(tǒng)的程序控制和數(shù)據(jù)處理采用軟件Breeze（Waters，MA，USA）。以保留時間（t）為橫坐標(biāo)，分子量的對數(shù)值（lg Mr）為縱坐標(biāo)，并采用以下已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線：牛血清白蛋白（67000 u）、細(xì)胞色素 C（12500 u）、桿菌肽（1450 u）、L-色氨酸（204 u）。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=-0.283X+7.981（R2=0.998，X為保留時間，Y為分子量的對數(shù)值 lg Mr）對各樣品的色譜峰進行區(qū)域劃分、積分，每塊區(qū)域的相對峰面積大小即為各分子量大小范圍的相對含量。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

參照文獻[11]進行影響因素優(yōu)化。

首先以發(fā)酵時間（0、1、2、3、4、5、6、7、8和9 d）為單一研究參數(shù)，研究最佳發(fā)酵時間參數(shù)，在確定發(fā)酵時間后，依次研究原料粉碎粒徑（不粉碎、20、40 和60目）、發(fā)酵溫度（28、31、34和37 ℃）、接種量（5、10、15和20%）、料液比（1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25）對發(fā)酵制備核桃多肽的影響，以多肽產(chǎn)量為指標(biāo)，進行試驗。

1.5 統(tǒng)計分析

提取或樣品測試均是三次平行，所有數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”，采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理，并做t檢驗分析，顯著性差異（p＜0.05）；數(shù)據(jù)采用Excel 2013進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃粕組成

經(jīng)實驗測得該核桃粕蛋白質(zhì)含量較高，是作為制備多肽的理想原料，豐富的蛋白質(zhì)為微生物降解肽鏈提供了理想的反應(yīng)基質(zhì)。

表1 核桃粕主要成分及含量（%）Table 1 Major content of walnut meal (%)

2.2 雙縮脲法測定多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

谷胱甘肽四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，此標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.0807x+0.0267，相關(guān)系數(shù)R2=0.9966。

2.3 發(fā)酵時間參數(shù)篩選

完整發(fā)酵周期內(nèi)，枯草芽孢桿菌與黑曲霉發(fā)酵多肽含量變化如下圖2所示，枯草芽孢桿菌、黑曲霉均能夠降解核桃蛋白并產(chǎn)生核桃多肽，其中枯草芽孢桿菌是細(xì)菌的典型代表，黑曲霉為真菌典型代表，細(xì)菌生長代謝速率較真菌快。其中枯草芽孢桿菌多肽產(chǎn)量隨著時間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在第3 d達到最大值，其多肽產(chǎn)量為196.51 mg/g(多肽質(zhì)量/干基發(fā)酵核桃粕質(zhì)量)；黑曲霉多肽產(chǎn)量也隨著時間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在第4 d達到最大值，其多肽產(chǎn)量為 136.48 mg/g (多肽質(zhì)量/干基發(fā)酵核桃粕質(zhì)量)。因此確定枯草芽孢桿菌最佳發(fā)酵時間為3 d；黑曲霉發(fā)酵最佳時間4 d，以此作為后續(xù)發(fā)酵的時間參數(shù)。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standardcurve of Gly-Gly-Tyr-Arg concentration

圖2 不同菌種發(fā)酵多肽曲線Fig.2 The peptides yield curve of Bacillus subtilis and Aspergillus niger

2.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化

枯草芽孢桿菌發(fā)酵核桃粕發(fā)酵時間 3 d，逐步對發(fā)酵過程中的原料粒徑、發(fā)酵溫度、接種量、料液比進行優(yōu)化，逐步確定最佳發(fā)酵條件。

2.4.1 原料粒徑對枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的影響

固態(tài)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間3 d，發(fā)酵溫度37 ℃，料水比 1:1，原料粒徑對枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的影響結(jié)果見下圖3。40目物料多肽產(chǎn)量顯著高于未粉碎物料（p＜0.05）。從不粉碎、20、40和60目四個水平進行考察，隨著原料粒徑的減小，核桃多肽產(chǎn)量逐漸上升，并在 40目時達到最大值，當(dāng)粒徑為60目時，核桃多肽產(chǎn)量逐漸下降。核桃粕粒徑對微生物利用核桃蛋白有較大的影響，較小的顆粒有較大的反應(yīng)表面積，因此枯草芽孢桿菌能較好地利用核桃粕顆粒表面的核桃蛋白；但是當(dāng)顆粒粒徑過小，核桃粕空隙減少，氧氣含量減少，微生物發(fā)酵效果減弱，從而導(dǎo)致核桃多肽產(chǎn)量的下降。不僅如此，60目較 40目能耗更高，綜合多肽產(chǎn)量和能耗兩方面原因，40目粉碎對枯草芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵制備多肽更為有利，因此選擇40目原料粒徑進行后續(xù)實驗。

圖3 原料粒徑對枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的影響Fig.3 The effect of partical size on the yield of peptides

2.4.2 發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵多肽的影響

圖4 溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature on the yield of walnut peptides

固態(tài)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間3 d，原料粒徑40目，接種量為5%，料水比1:1。發(fā)酵溫度對多肽含量的影響結(jié)果如下圖4所示，各處理組多肽含量差異不顯著（p＞0.05），在28～37 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，發(fā)酵后多肽產(chǎn)量受培養(yǎng)基中水分含量影響較大，溫度越高，固體發(fā)酵培養(yǎng)基中水分丟失越快，越不利于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時，固態(tài)發(fā)酵制備的多肽產(chǎn)量最高，可達165.11 mg/g，為節(jié)約資源，選擇28 ℃作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度參數(shù)。

2.4.3 接種量對枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的影響

枯草芽孢桿菌種子液為107cfu/mL，不同接種量對枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的影響結(jié)果如下圖5所示，接種量為5%時，固態(tài)發(fā)酵制備多肽的產(chǎn)量最高，可以達到154.36 mg/g，因此選取5%接種量進行后續(xù)實驗。隨著接種量的增加，發(fā)酵后的多肽產(chǎn)量略有下降，各組之間差異不顯著(p＞0.05)，從節(jié)約資源角度，選擇5%作為后續(xù)實驗接種量。

圖5 接種量對枯草芽孢桿菌制備核桃多肽產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of inoculation quantity on the yield of walnut peptides

2.4.4 料液比對枯草芽孢桿菌發(fā)酵多肽的影響

圖6 料液比對枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的影響Fig.6 The effect of liquid/material on the yield of walnut peptides

固態(tài)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間3 d，原料粒徑40目，菌種接種量為5%，發(fā)酵溫度28 ℃。不同料液比對多肽產(chǎn)量的影響結(jié)果如下圖6所示，在1:0.5到1:1.25的范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，多肽產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)料液比為 1:1.25（核桃粕與添加蒸餾水的比值）時多肽產(chǎn)量達到最大，在此條件下發(fā)酵后多肽產(chǎn)量顯著提高（p＜0.05），最大產(chǎn)量為 243.97 mg/g。由于水分的增加，微生物能更好地利用固態(tài)培養(yǎng)基中的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，從而具有更好的發(fā)酵產(chǎn)多肽效果。而水分較低時，不利于固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中微生物的生長，可能降低菌體代謝速率，從而影響多肽產(chǎn)量。

2.5 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

黑曲霉發(fā)酵核桃粕發(fā)酵時間 4 d，逐步對發(fā)酵過程中的原料粒徑、發(fā)酵溫度、接種量、料液比進行優(yōu)化，逐步確定最佳發(fā)酵條件。

2.5.1 原料粒徑對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵多肽產(chǎn)量的影響

圖7 原料粒徑對黑曲霉發(fā)酵制備核桃多肽產(chǎn)量的影響Fig.7 The effect of partical size on the walnut yield of peptides

固態(tài)發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間4 d，料液比 1:1。原料粒徑對黑曲霉發(fā)酵多肽產(chǎn)量的影響結(jié)果如下圖7所示。原粒徑、20目、40目多肽產(chǎn)量差異不顯著，但都比60目多肽產(chǎn)量顯著高（p＜0.05）。隨著粒徑的減小多肽產(chǎn)量小幅先上升后下降，并在40目達到最大，為 150.92 mg/g。與此同時不粉碎、20目發(fā)酵的多肽含量差不多，這是由于黑曲霉的穿透性好，能夠進入顆粒內(nèi)部充分地利用核桃粕。當(dāng)原料粒徑小于40目，固體培養(yǎng)基中的水分完全被培養(yǎng)基顆粒表面的微孔等吸收，同時原料粒徑過小使得原料空隙減少，而造成氧氣減少，使得黑曲霉生長減緩，菌體繁殖代謝受到影響，從而減少多肽產(chǎn)量。因此選擇40目為后續(xù)實驗粒徑參數(shù)。

2.5.2 發(fā)酵溫度黑曲霉發(fā)酵多肽產(chǎn)量的影響

圖8 溫度對黑曲霉發(fā)酵制備核桃多肽的影響Fig.8 The effect of fermentation temperature on the walnut yield of peptides

固態(tài)發(fā)酵條件：發(fā)酵時間4 d，料液比1:1，原料粒徑40目，接種量10%。發(fā)酵溫度對黑曲霉發(fā)酵多肽產(chǎn)量的影響結(jié)果如下圖8所示，該黑曲霉最適生長溫度為28 ℃，隨著溫度的增加，會使黑曲霉代謝速率下降，從而造成發(fā)酵后多肽產(chǎn)量降低。在28 ℃時，黑曲霉發(fā)酵多肽產(chǎn)量顯著高于其他組（p＜0.05），最大為120.35 mg/g，因此選擇28 ℃為后續(xù)發(fā)酵溫度。

2.5.3 接種量對黑曲霉發(fā)酵多肽的影響

圖9 接種量對黑曲霉發(fā)酵多肽的影響Fig.9 The effect of inoculation quantity on the yield of walnut peptides

固態(tài)發(fā)酵條件：發(fā)酵時間4 d，料液比1:1，原料粒徑40目。接種量對黑曲霉發(fā)酵多肽產(chǎn)量的影響結(jié)果如下圖9所示，隨著接種量的增加，固態(tài)發(fā)酵多肽產(chǎn)量逐漸增加，并且當(dāng)接種量達到15%時，多肽產(chǎn)量顯著高于其他組（p＜0.05），可達到 132.92 mg/g，隨著接種量的繼續(xù)增加，多肽產(chǎn)量不再增加。合適的接種量可以縮短微生物的延滯期，到發(fā)酵后期微生物利用多肽、氨基酸比例增加導(dǎo)致培養(yǎng)基中多肽含量減少，因此選用15%作為最適接種量。接種量小，接入菌體量減少，發(fā)酵時微生物生長緩慢，延滯期較長，蛋白分解速率降低導(dǎo)致多肽產(chǎn)量不高；而接種量過高，微生物綜述在短時間內(nèi)可以達到峰值，黑曲霉生長盤復(fù)交錯，導(dǎo)致核桃粕結(jié)塊，外部氧氣無法進入核桃粕中，黑曲霉代謝下降，多肽產(chǎn)量下降。

2.5.4 料液比對黑曲霉發(fā)酵多肽的影響

圖10 料液比對黑曲霉發(fā)酵制備核桃多肽的影響Fig.10 The effect of liquid/material on the yield of walnut peptides

固態(tài)發(fā)酵條件：發(fā)酵時間4 d，發(fā)酵溫度28 ℃，原料粒徑40目，接種量20%，考察料液比對黑曲霉發(fā)酵多肽產(chǎn)量的影響。實驗結(jié)果如下圖10所示，隨著蒸餾水添加量的增加，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢，并在料液比為1:1.25時顯著高于其他組（p＜0.05），為158.61 mg/g。培養(yǎng)基中水分含量過低，黑曲霉代謝速率低，不利于其產(chǎn)酶，隨著水分的增加，微生物可利用的水增加，代謝更加活躍，因此多肽產(chǎn)量隨之提高。

2.6 最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵產(chǎn)物分子量分布

圖11 發(fā)酵前核桃粕中水溶性蛋白及多肽HPGPC圖譜Fig.11 HPGPC chromatograph of walnut peptides before fermentation

圖12 枯草芽孢桿菌發(fā)酵后核桃粕中水溶性蛋白及多肽HPGPC圖譜Fig.12 HPGPC chromatograph of walnut peptides after fermentation

圖13 黑曲霉發(fā)酵后核桃粕中水溶性蛋白及多肽HPGPC圖譜Fig.13 HPGPC chromatograph of walnut peptides after fermentation

枯草芽孢桿菌最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時間 3 d、原料粒徑40目、發(fā)酵溫度28 ℃、接種量5%、料液比1:1.25；黑曲霉最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時間4 d、原料粒徑40目、發(fā)酵溫度28 ℃、接種量15%、料液比1:1.25。核桃粕發(fā)酵前后HPGPC圖譜如下圖11～13所示，結(jié)合表 2～4可以看出，發(fā)酵前（經(jīng)滅菌后），核桃粕中大分子蛋白不可溶，僅極少量小分子（分子量小于150 u）物質(zhì)（包括游離氨基酸）是水溶性的，幾乎無大分子溶出。

黑曲霉最佳條件發(fā)酵過后，其分子量分布與原料發(fā)酵前相似，大部分物質(zhì)都為1000 u以下，且預(yù)處理處理條件相同，其 AU值較低因此可以斷定黑曲霉GIM3.452固態(tài)發(fā)酵核桃粕制備多肽效果不佳?？莶菅挎邨U菌10160發(fā)酵后其分子量分布如下表3所示，其組分中分子量≥150 u的分子多達78.47%，不僅如此其縱坐標(biāo)AU值也較高，大部分均為可溶，在枯草芽孢桿菌生長的過程中，其分泌的胞外蛋白酶使得大分子蛋白降解成為小片段，同時親水性增加，這樣更有利于枯草芽孢桿菌利用微環(huán)境中的水分將多肽和氨基酸吸收以供菌體代謝之用，因此枯草芽孢桿菌更適合于核桃多肽的發(fā)酵。

表2 發(fā)酵前核桃粕中水溶性蛋白及多肽分子量分布Table 2 Distribution of molecular weight of walnut peptides before fermentation

表3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵后核桃粕中水溶性蛋白及多肽分子量分布Table 3 Distribution of molecular weight of walnut peptides before fermentation

表4 黑曲霉發(fā)酵后核桃粕中水溶性蛋白及多肽分子量分布Table 4 Distribution of molecular weight of walnut peptides before fermentation

3 結(jié)論

本實驗以單因素實驗為基礎(chǔ)進行逐級優(yōu)化，以多肽產(chǎn)量為指標(biāo)，對枯草芽孢桿菌和黑曲霉進行了發(fā)酵時間、原料粒徑、發(fā)酵溫度、菌種接種量、料液比等五項固態(tài)發(fā)酵條件參數(shù)進行了優(yōu)化，枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵最佳發(fā)酵參數(shù)：發(fā)酵時間3 d，原料粒徑40目，發(fā)酵溫度28 ℃，菌種接種量5%，料液比1:1.25，在此條件下經(jīng)發(fā)酵后核桃多肽含量為243.97 mg/g。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵最佳發(fā)酵參數(shù)：發(fā)酵時間 4 d，原料粒徑40目，發(fā)酵溫度 28 ℃，菌種接種量 15%，料液比1:1.25，在此條件下經(jīng)發(fā)酵核桃多肽含量為 158.61 mg/g。以最優(yōu)條件進行兩菌的固態(tài)發(fā)酵實驗，經(jīng)分子量分布測定，枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白、多肽及氨基酸含量顯著高于黑曲霉，發(fā)酵后大于150 u組分大幅提高表明枯草芽孢桿菌更適合于固態(tài)發(fā)酵核桃粕進行生物多肽的制備。