依達(dá)拉奉對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用

吳 昊

（南召縣人民醫(yī)院，河南 南召 474650）

依達(dá)拉奉對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用

吳 昊

（南召縣人民醫(yī)院，河南 南召 474650）

目的 糖尿病是一種代謝性疾病，各種器官的結(jié)構(gòu)和功能都發(fā)生了一定改變，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)的研究目標(biāo)探討依達(dá)拉奉的對(duì)糖尿病大鼠腦缺血損傷保護(hù)作用。方法 ①應(yīng)用高劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制作實(shí)驗(yàn)型 2 型糖尿病大鼠模型。②非糖尿病大鼠（n=20）和糖尿病大鼠（n=60）均制作大腦中動(dòng)脈腦缺血模型。制模后局部大腦中動(dòng)脈缺血 30min 再給給予依達(dá)拉奉及 24h 再灌注。三十只糖尿病大鼠 MCAO 30min 后，立即依達(dá)拉奉（100mg/kg，腹腔）。PCR 檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)因子 (AIF)被用來(lái)評(píng)估細(xì)胞凋亡。免疫組化檢測(cè)細(xì)胞色素 C。結(jié)果 依達(dá)拉奉治療后糖尿病大鼠的凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞色素 C 較無(wú)藥物治療的明顯減低（P＜0.05）。免疫組化檢測(cè)細(xì)胞色素 C。結(jié)論 依達(dá)拉奉治療后糖尿病大鼠上減少改善糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷可能通過(guò)減低凋亡誘導(dǎo)因子，細(xì)胞色素 C。

依達(dá)拉奉；糖尿病大鼠腦缺血再灌注；細(xì)胞色素C；凋亡相關(guān)蛋白

眾所周知，糖尿病患者有中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)高，表現(xiàn)在發(fā)病率以及其相關(guān)的病死率和再發(fā)率。在人類和大鼠的糖尿病，氧化應(yīng)激是糖尿病主要的致病原因。依達(dá)拉奉被認(rèn)為是很好的抗自由基藥物。但依達(dá)拉奉對(duì)糖尿病大鼠腦缺血再灌注的影響未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康雄性清潔級(jí)SD大鼠80只，體質(zhì)量250～300g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠被分配到三組：①M(fèi)組，缺血30min，隨后再灌注24h（n=20）血糖正常大鼠；②D-M組，糖尿病大鼠30min腦缺血，再灌注24h組（n=30）；③D-A組，與糖尿病大鼠缺血30min立即腹腔注射AGM（60mg/kg溶于生理鹽水中）（n=30）。

1.2 主要試劑與儀器

依達(dá)拉奉昆明積大有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字（H20080466)；細(xì)胞色素C兔抗鼠多克隆抗體( 北京博奧森bs-0013R)；PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司AE301-02)。圖像采集系統(tǒng)(德國(guó)Leica顯微照相系統(tǒng))；分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1．6)；RT-PCR 圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific D140)；PCR GeneAmp System(美國(guó)AppliedBiosystems2700)；電泳儀(北京市六一儀器廠，DYY-6C)。

1.3 糖尿病建模

8周齡大鼠禁食10h，用STZ(Sigma 公司)溶于0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)，配成1%的溶液，按60mg/kg單次腹腔注射，5d后取尾靜脈血，用血糖儀測(cè)定血糖，血糖≥16.7mmol/L為DM大鼠(成模率100%)。將造模大鼠禁食10h后，以STZ 60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射。24h后測(cè)血。24h后測(cè)血糖濃度＞13.8mmol/L時(shí)，成為DM模型鼠。動(dòng)物用4d后無(wú)胰島素補(bǔ)充。

1.4 MCAO模型和分組

大鼠仰臥位被放置在一個(gè)加熱墊，使用直腸體溫保持在（37± 0.5）℃溫度計(jì)。在手術(shù)顯微鏡下包括常見(jiàn)的頸動(dòng)脈及其分支揭露和剖析。左頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈通過(guò)正中切口暴露。仔細(xì)分離并切斷頸外動(dòng)脈分支，結(jié)扎并游離頸外動(dòng)脈主干，分離頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈殘端剪一小口，4-0單絲尼龍縫線與火焰圓頭通過(guò)頸外動(dòng)脈的一個(gè)小切口插入。從常見(jiàn)的分叉的距離頸動(dòng)脈縫合的一角約為18.5mm所有大鼠，這是與已公布的一致MCAO模型的描述。大鼠24h再灌注后殺害。MCAO模型成功標(biāo)準(zhǔn)選擇拔除尼龍縫線成活后，行走時(shí)向左側(cè)打彎或左側(cè)肢體癱瘓的大鼠。

表1 各組大鼠腦組織細(xì)胞色素C、AIF 表達(dá)的比較(χ—±s，n = 6)

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞色素C

灌注，固定，包埋，切片。每只大鼠選取皮質(zhì)區(qū)5個(gè)不同高倍視野光鏡下計(jì)數(shù)。

1.5.1 RT-PCR檢測(cè)AIF mRNA的表達(dá)

①組織總RNA提取采用Trizol一步法提取組織總RNA。②RT反應(yīng)：按試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)cDNA 20μL。③將大鼠腦組織常規(guī)研磨提取總RNA。AIF為108 bp，上游引物為：5'-TAT GAC TGGAGC TGC TAA G-3'，下游引物為：5'-GTG GGC AAA CTA CTA TCC-3'；內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物大小為568 bp，上游引物為：5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC-3'，下游引物為：5'-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3'。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min； 94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6min。④瓊脂糖凝膠電泳:取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進(jìn)行電泳，后在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.5.2 結(jié)果判斷

目的基因AIFmRNA的表達(dá)量和β-actin的DNA條帶灰度值比值計(jì)算得到其相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用秩和檢驗(yàn)，采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織細(xì)胞色素C表達(dá)的比較見(jiàn)表1。對(duì)照組和治療組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞色素C 的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（均P＜0.05），但治療組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞色素C的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織AIF表達(dá)的比較見(jiàn)表1。對(duì)照組和治療組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)AIF的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(均P＜0.05)，但治療組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)AIF 的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討 論

依達(dá)拉奉做為一種新的自由基清除劑，最早在日本上市，化學(xué)名為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。依達(dá)拉奉有直接清除NO、羥自由基及抗氧化活性作用。能減少腦缺血?jiǎng)游锕Ｋ荔w積、提高神經(jīng)功能評(píng)分及減輕腦水腫。依達(dá)拉奉作用后的主要代謝產(chǎn)物阻止半暗帶區(qū)細(xì)胞死亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用，進(jìn)一步明確其保護(hù)作用發(fā)生的分子機(jī)制有著重要意義，可為臨床使用自由基清除劑、改善預(yù)后，提供明確的理論基礎(chǔ)。

糖尿病中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病患者增加1.5～3倍，復(fù)發(fā)中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)也是加倍的[1,2]。在神經(jīng)元的葡萄糖毒性增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖氧化，產(chǎn)生活性氧[3]，氧自由基可能會(huì)導(dǎo)致直接損害腦線粒體損傷的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)元凋亡是腦缺血-再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的基本形式[4]。線粒體代謝障礙是細(xì)胞凋亡上游的重要始動(dòng)因素，細(xì)胞色素C和AIF分別代表了caspase依賴性和非caspase 依賴性細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子。細(xì)胞色素C是一種水溶性蛋白，由核基因編碼，其相對(duì)分子質(zhì)量為12～13kDa，位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)，呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ～Ⅳ之間，對(duì)線粒體能量代謝起到了重要的調(diào)節(jié)作用。線粒體細(xì)胞色素C可以通過(guò)對(duì)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)和放大作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。腦缺血-再灌注后，線粒體膜損傷，引起線粒體細(xì)胞色素C 釋放至胞漿，細(xì)胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子-1，與caspase-9結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，再活化caspase-3、7并促進(jìn)凋亡復(fù)合體的形成[5,6]。本研究結(jié)果表明，缺血-再灌注可以刺激線粒體釋放促凋亡蛋白和細(xì)胞色素C，而糖尿病大鼠缺血-再灌注可增加腦缺血-再灌注后線粒體細(xì)胞色素C的釋放，依達(dá)拉奉治療后的糖尿病大鼠缺血-再灌注可減低腦缺血-再灌注后線粒體細(xì)胞色素C。AIF有線粒體定位信號(hào)，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化還原酶的作用。在凋亡信號(hào)刺激下，AIF轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與線粒體蛋白endonuclease G一起作用于核DNA導(dǎo)致DNA片斷化(平均50kb)[7]。AIF是一重要的非caspase依賴性凋亡調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，缺血-再灌注可刺激線粒體釋放促凋亡蛋白AIF，尤其在糖尿病大鼠的缺血再灌注中，而依達(dá)拉奉可以減少糖尿病大鼠腦缺血-再灌注后線粒體促凋亡蛋白AIF的釋放，提示依達(dá)拉奉可以通過(guò)非caspase依賴性途徑抑制細(xì)胞凋亡。綜上所述，依達(dá)拉奉可下調(diào)腦缺血-再灌注大鼠腦組織細(xì)胞色素C、AIF的表達(dá)并減少其細(xì)胞凋亡[8]。

依達(dá)拉奉抑制細(xì)胞凋亡可能與減輕線粒體損傷，抑制線粒體通路的凋亡途徑有關(guān)。

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