沙棘油抑制小鼠胸腺細胞凋亡機制的初步探討

朱 煜

（山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學，山西 太原 030001）

沙棘油抑制小鼠胸腺細胞凋亡機制的初步探討

朱 煜

（山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學，山西 太原 030001）

目的 初步探討沙棘油對脂多糖（LPS）誘導的小鼠胸腺細胞凋亡的抑制作用及其機制。方法 取小鼠胸腺細胞進行分離培養(yǎng)，分為空白對照組；LPS 組；沙棘油與 LPS 合用組。然后進行相關基因、蛋白的檢測。結果 基因表達結果，與對照組相比：LPS 組 caspase-3 NF-κB LC3- Ⅱ表達量均增加差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；LPS+ 沙棘油組 caspase-3 NF-κB 表達量均增加差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；與 LPS 組相比 LPS+ 沙棘油組 caspase-3 表達量下降差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）與對照組相比：LPS 刺激組 Caspase3、8、9 蛋白表達量均增加差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；LPS+ 沙棘油組 Caspase3、8、9 蛋白表達量均增加差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；與 LPS 刺激組相比 LPS+ 沙棘油組 Caspase3、9 表達量下降差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。結論 沙棘油對 LPS 誘導的小鼠胸腺細胞的凋亡有一定抑制作用且其抑制 casepase 通路中的線粒體途徑是其可能的機制。

沙棘油；細胞凋亡

沙棘油是從沙棘果實中提取的植物油，含有黃酮類化合物、白花青素、苦木素、香豆素、5-羥色胺等，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤等作用[1,2]。內毒素是革蘭陰性菌細胞壁上的特有結構，其化學成分為脂多糖，它是導致膿毒癥的主要致病因子，可引起胸腺萎縮和胸腺淋巴細胞凋亡[3]。本實驗通過LPS誘導胸腺淋巴細胞凋亡模型來初步探討沙棘油的抗凋亡作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CO2恒溫培養(yǎng)箱：Heraeus，德國；超凈工作臺：蘇州安泰；熒光定量PCR儀：美國STRATAGENE公司；電泳儀、轉膜儀：BIO-RAD生產；酶標儀：Becton-Dickin-son美國；捷達凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)：江蘇省捷達。

脂多糖Sigma美國；Caspase-3、8、9 GAPDH、引物：寶生物工程有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒、RealMasterMix熒光染料：天根生化科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司；Caspase-3 goat monoclonal lgG、Caspase-8、Caspase-9rabbit monoclonal lgG：美國santa cruz公司；兔抗山羊IgG/生物素標記、鼠抗兔IgG/辣根酶標記鏈酶卵白素：北京中杉金橋。

1.2 胸腺細胞分離及細胞分組

脫臼處死小鼠，無菌取出胸腺，研磨過濾制成細胞懸液用PBS清洗后，進行細胞計數(shù)，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。將接種過夜的細胞進行分組處理，分為空白對照組；LPS組（50μg/mL）；沙棘油（50μg/mL）與LPS（50μg/mL）合用組。

1.3 基因表達情況測定

按照反轉錄試劑盒說明書操作反轉錄后，Caspase-3、GAPDH、LC3-Ⅱ、NF-κB檢測條件：94℃ 5min，94℃ 50s，53℃ 50s，72℃1min，第二步到第四步35個循環(huán)，然后94℃ 1min，55℃ 30s，95℃30s 收集熒光信號測定。

1.4 Western-blot法檢測相關蛋白表達情況

跑膠、轉膜、封閉、加抗體顯影后采用捷達凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對結果進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均采用（χ—±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用單因素方差分析，用LSD法進行兩兩比較，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0顯著性水平為P＜0.05。

2 結 果

2.1 基因表達結果

與對照組相比：LPS組caspase-3 NF-κB LC3-Ⅱ表達增加差異有統(tǒng)計學意義；LPS+沙棘油組caspase-3 NF-κB表達增加差異有統(tǒng)計學意義；與LPS組相比LPS+沙棘油組caspase-3 表達下降差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 基因表達結果（χ—±s）

2.2 相關蛋白表達結果

與對照組相比：LPS組Caspase3、8、9蛋白表達量均增加差異有統(tǒng)計學意義；LPS+沙棘油組Caspase3、8、9蛋白表達量均增加差異有統(tǒng)計學意義；與LPS刺激組相比LPS+沙棘油組Caspase3、9表達量下降差異有統(tǒng)計學意義。見表2。相關蛋白表達圖見圖1。

表2 相關蛋白表達結果（χ—±s）

圖1 相關蛋白表達圖

3 討 論

胸腺是T淋巴細胞發(fā)育成熟的場所。胸腺細胞過度凋亡將影響外周T淋巴細胞的數(shù)量和功能，影響機體免疫狀態(tài)。業(yè)已證明將內毒素注射到小鼠體內或將胸腺細胞分離后體外培養(yǎng)，均可觀察到胸腺細胞明顯凋亡。

Caspase家族被認為是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者。未活化的procaspases可分為啟動因子（如caspase-8和caspase-9）和效應分子（如caspase-3和caspase-7），啟動caspase的激活能導致效應caspase的激活[4]。Caspase-3是最主要的效應caspase，通過兩種機制激活：死亡受體通路或線粒體通路[5]。分為caspase-8介導的死亡受體通路和caspase-9介導的線粒體通路二者均可使caspase-3激活導致細胞凋亡[6,7]。本實驗結果顯示LPS組Casepase-3，8，9表達量均增加差異有統(tǒng)計學意義，與LPS組相比LPS+沙棘油組Casepase-3，9表達量均有降低，提示沙棘油對LPS誘導的胸腺細胞的凋亡有一定抑制作用，線粒體途徑可能是其作用機制途徑之一。

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