醛糖還原酶5’端兩種基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的相關(guān)性研究

李 艷劉長山* 程 碩

（1 濰坊醫(yī)學院，山東 濰坊 261041；2 濰坊市人民醫(yī)院，山東 濰坊 261041）

醛糖還原酶5’端兩種基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的相關(guān)性研究

李 艷1劉長山2* 程 碩1

（1 濰坊醫(yī)學院，山東 濰坊 261041；2 濰坊市人民醫(yī)院，山東 濰坊 261041）

目的 探討醛糖還原酶（AR）基因啟動子區(qū) C（-106）T 單核苷酸多態(tài)性和 2.1Kb 處（AC）n 二核苷酸微衛(wèi)星多態(tài)性與 2 型糖尿病腎病（DN）的關(guān)系。方法 用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、測序及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測 AR 基因兩多態(tài)位點的基因型及等位基因，比較各組分布頻率。結(jié)果 在 DM 組和 CON 組均發(fā)現(xiàn) AR 基因 C（-106）T 多態(tài)位點存在 C、T 兩種等位基因和 CC、CT、TT 三種基因型，(AC)n序列的 7 種等位基因（Z-6～Z+6）；T、Z-2 等位基因及 CT+TT 及含有 Z-2 的基因型在 DN 組明顯高于 NDN 和 CON 組，但在 DM 組和CON 組之間無顯著性差異。結(jié)論 AR 基因 C（-106）T 多態(tài)位點的 T 等位基因及 (AC)n 多態(tài)位點的 Z-2 等位基因可能是 DN 的易感基因。

2型糖尿??；醛糖還原酶；糖尿病腎??；遺傳

糖尿病腎?。―N）是糖尿?。―M）常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，為終未期腎衰竭的主要病因，也是DM患者致死、致殘的主要原因。遺傳因素在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。醛糖還原酶（AR）是多元醇通路的限速酶，該基因表達異?；蛎富钚陨邔⒋龠M糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。但編碼該酶的基因變異與DN的相關(guān)性報道不一[1-3]。本研究旨在探討山東地區(qū)漢族人群中AR基因5’端的C（-106）T和（AC）n多態(tài)性與DN易感性的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象

2型糖尿?。―M）組：按1999年WHO糖尿病診斷標準，選自2011年3月至2012年9月我院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者192例，均為山東漢族人，彼此無血緣關(guān)系，所有患者病程均超過10年。并排除其他各種急慢性疾病。根據(jù)尿微量白蛋白排泄率（UAER）分為兩亞組：①DN組：共98例，男50例，女48例，年齡49～80歲，平均（64.92±8.49）歲，病程為（14.1±3.8）年。入選標準為6個月內(nèi)連續(xù)3次測定UAER≥20μg/min，并排除由心、肝和其他全身疾病或原發(fā)泌尿系統(tǒng)疾病及應(yīng)用影響腎功能藥物引起微量白蛋白尿者。②NDN組：共94例，男44例，女50例，年齡46～79歲，平均（63.86 ±7.98）歲，病程為（12.4±3.6）年，6個月內(nèi)連續(xù)3次測UAER＜20μg/min。正常對照（CON）組：選自我院健康查體者101例，口服75g葡萄糖耐量試驗正常，男61例，女40例，年齡40～70歲，平均（60.67±7.68）歲。

1.2 方法

①生化指標檢測：高壓液相法測糖化血紅蛋白（HbA1C）、UAER，葡萄糖氧化酶法測血糖。②基因組DNA提取：用Solarbio全血基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）從外周血白細胞中提取DNA，紫外分光光度計測量DNA的濃度，于-20℃保存。③聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：C（-106）T引物序列參照文獻[4]。（AC）n引物序列參照文獻[2]。均由上海生工生物工程有限公司合成（PAGE純化，純度≥99%）。PCR總反應(yīng)體系25μL，含DNA、引物各1.0μL、10× Buffer2.5μL、dNTP、Taq DNA聚合酶0.25μL、滅菌三蒸水19μL。參數(shù)為：94℃5min，94℃30s，66℃30s，72℃1min，共32個循環(huán)，最后于72℃終止10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝片。④PCR擴增產(chǎn)物測序：將擴增產(chǎn)物DNA樣本送至上海生工生物工程有限公司進行純化及測序，根據(jù)測序結(jié)果確定AR基因的等位基因及基因型。

1.3 統(tǒng)計學方法

正態(tài)分布臨床資料用均數(shù)±標準差（χ—±s）表示，組間比較用t檢驗。各組間基因型和等位基因頻率比較用χ2檢驗。α=0.05。數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 一般檢測結(jié)果

表1示DN組病程、MBP、FPG、HbA1C、UAER均高于其余2組，有顯著性差異，其余指標在各組間無顯著性差異。

2.2 C（-106）T基因多態(tài)性檢測結(jié)果 根據(jù)測序結(jié)果與AR基因序列進行比對，觀察-106位點基因測序結(jié)果及對應(yīng)測序曲線，-106位點單峰表示CC/TT基因型（圖1），套峰表示CT基因型。AR基因C（-106）T等位基因及基因型分布頻率在DM與CON組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.029，P = 0.868；χ2=0.068，P =0.985）；TT+CT基因型頻率在DN組顯著高于NDN組（χ2=12.65，P=0.003）；T等位基因頻率在DN組顯著高于NDN組（χ2=11.01，P =0.004），見表2。

表1 各組一般情況及臨床資料比較（χ—±s）

圖1 -106位點單峰表示CC/TT基因型

表2 AR基因C(-106)T多態(tài)基因型及等位基因分布頻率[例(%)]

2.3 （AC）n雙核苷酸多態(tài)性檢測結(jié)果

將最常見的等位基因命名為Z，其純合子樣本DNA測序結(jié)果為（AC）24，與國外所用命名一致。按（AC）n的重復(fù)數(shù)n 21～27，依次命名為Z-6、Z-4、Z-2、Z、Z+2、Z+4、Z+6（圖2）。DN組Z-2等位基因頻率高于NDN和CON組（χ2=13.08、10.62，P＜0.01），DN組含Z-2等位基因的基因型頻率高于NDN和CON組（χ2=11.22、12.31，P＜0.01），差異均有顯著意義。等位基因及基因型分布頻率在DM與CON組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.832，P=0.920；χ2=0.361，P=0.912）。

2.4 兩種多態(tài)位點聯(lián)合的分布頻率比較

將攜帶C（-106）T多態(tài)位點C、T等位基因和（AC）n多態(tài)位點Z-2、X等位基因的基因型與糖尿病腎病相分析，發(fā)現(xiàn)Z-2/C、Z-2/T、X/ T基因型在DN組均高于NDN組（χ2=11.08、14.65、10.97，P＜0.01）；X/C基因型在DN組低于NDN組（χ2=46.32，P＜0.01）。見表3。

3 討 論

圖2 命名

表3 AR基因（AC）n/C（-106）T在各組中的分布頻率[例（%）]

AR是多元醇通路的關(guān)鍵酶，催化NADPH依賴的醛糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇。AR對葡萄糖的親和力較低，但在高糖條件下可能被激活。AR作為潛在的候選基因產(chǎn)物參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制也因此引起了研究人員的極大興趣，并受到廣泛關(guān)注[5]。目前的研究表明，AR啟動子區(qū)C（-106）T單核苷酸多態(tài)性和轉(zhuǎn)錄起止點上游-2.1kb處的（AC）n微衛(wèi)星多態(tài)性與糖尿病腎病的發(fā)病可能相關(guān)，但呈現(xiàn)出一定的地區(qū)和民族差異[2]。本研究顯示，山東地區(qū)漢族人群中也存在該多態(tài)性，DN組Z-2、T等位基因頻率及含Z-2、T等位基因的基因型頻率顯著高于NDN組和CON組，提示AR基因的Z-2和T等位基因可能是DN的易感因素。由于這兩個多態(tài)位點距離較近，是否存在連鎖不平衡尚不得而知。糖尿病腎病是多基因遺傳病，與環(huán)境和遺傳等多種因素有關(guān)，發(fā)病機制尚不明確，有待于進一步加大樣本進行多種族、多地區(qū)的研究。

[1]Katakami N,Kaneto H,Takahara M,et al.Aldose reductase C(-106) T gene polymorphism is associated with diabetic retinopathy in Japanese patients with type 2 diabetes[J].Diabetes Res Clin Pract, 2011,92(3):57-60.

[2]Neamat-Allah M,Feeney SA,Savage DA,et al.Analysis of the asso -ciation between diabetic nephropathy and polymorphism in the aldose reductase gene in type 1 and type 2 diabetes mellitus [J]. Diabet Med,2001,18(11):906-914.

[3]Yamamoto T,Sato T,Fee S,et al.Aldose reductase gene polymorphism is associated with progression of diabetic nephropathy in Japanese patients with typeⅠdiabetes mellitus[J].Diabetes Obes Metab,2003,5(1):51-57.

[4]Moczulski DK,Scott L.Aldose reductase gene polymorphisms and susceptibility to diabetic nephropathy in Type 1 diabetes mellitus [J].Diabet Med,2000,17(2):111-118.

[5]Donaghue KC,Margan SH,Chan AKF,et al.The association of aldose reductase gene(AKR1B1) polymorphisms with diabetic neuropathy in adolescents[J].Diabet Med,2005,22(10):1315-1320.

The Relationship between the Two Polymorphisms at the 5’-end of the Aldose Reductase Gene and Diabetic Nephropathy

LI Yan1, LIU Chang-shan2*, CHENG Shuo1
(1 Weifang Medical University, Weifang 261041, China; 2 Weifang People's Hospital, Weifang 261041, China)

ObjectiveTo investigate the relationship of aldose reductase gene promoter area C(-106)T single nucleotide polymorphism and 2.1 Kb place (AC)n dinucleotide microsatellite polymorphism and type 2 diabetes nephropathy.MethodsUsing polymerase chain reaction（PCR), sequencing and agarose gel electrophoresis technology detection AR gene genotype and allele, compare the frequency distribution.ResultT, Z-2 allele and CT+TT, Z-2 genotype in DN group is obviously higher than that of the NDN and CON group, but in DM group and CON no significant differences.ConclusionBoth the T allele of C(-106)T polymorphism and the Z-2 allele of (AC)n polymorphism at AR gene may be susceptibility genes of DN.

Type 2 diabetes; Aldose reductase; Diabetic nephropathy; Genetic

R587.2

：B

：1671-8194（2013）06-0005-02

*通訊作者