Th17細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠發(fā)病中的表達(dá)及依達(dá)拉奉的保護(hù)作用研究①

董 梅 張美月 陳 欣 劉 露 劉瑞春 郭 力

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 神經(jīng)病學(xué)河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050000)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?，發(fā)病機(jī)制尚不明確。實(shí)驗(yàn)性自身反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS公認(rèn)的動(dòng)物模型。Th1細(xì)胞曾被認(rèn)為是造成自身免疫性疾病組織破壞的唯一T細(xì)胞亞群，然而Th17細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)［1］。

依達(dá)拉奉(Edaravone)是一種氧自由基清除劑，能透過(guò)血腦屏障，通過(guò)消除脂質(zhì)過(guò)氧化和羥基，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，阻止腦水腫和腦梗塞的進(jìn)展，改善缺血神經(jīng)的損傷，在臨床上主要用于治療急性缺血性腦血管病。Fischer等［2］利用基因芯片證實(shí)MS活動(dòng)性病灶中存在線粒體的損傷，與炎癥相關(guān)的氧化損傷在MS脫髓鞘中起重要作用;有研究表明Edaravone能顯著減輕EAE的臨床癥狀，減少脊髓中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)［3］，提示抗氧化劑 Edaravone在炎癥性脫髓鞘疾病中可能具有治療價(jià)值。

我們建立EAE模型，選取Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子作為研究對(duì)象，探討其在EAE發(fā)病中的動(dòng)態(tài)變化及意義，并探討Edaravone對(duì)EAE的治療作用及其機(jī)制，為MS新的臨床藥物治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料與模型建立

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar大鼠(合格證編號(hào):1006151)175只，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6～8周齡，體重180～220克;清潔級(jí)豚鼠28只(雌雄不限)，體重350～450克。以標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水喂養(yǎng)，室溫20～25℃。

1．1．2 主要試劑 兔抗大鼠RORgamma多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自南京先聲東元制藥有限公司，10 mg/5 m l;大鼠 IL－6、IL－17酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于美國(guó)RD公司;反義核酸第一鏈cDNA合成試劑盒，SYBR qPCR綠色體系均購(gòu)于加拿大Fermentas公司;Trizol組織RNA提取液，DEPC原液均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)公司;引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1．1．3 模型建立及分組 以豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)，為抗原進(jìn)行免疫，建立Wistar大鼠EAE動(dòng)物模型。隨機(jī)分為Edaravone組和EAE組，自免疫當(dāng)日起，EAE組給予大鼠腹腔注射生理鹽水1 ml/d，Edaravone組按10 mg/(kg·d)給藥直至處死，各組分別于免疫后第10天(發(fā)病前期)，發(fā)病后3天(急性期)，發(fā)病后7天(緩解期)取材。

1．1．4 神經(jīng)功能評(píng)分 采用通用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分:不發(fā)病;1分:動(dòng)物尾部無(wú)力;2分:后肢輕度癱瘓+步態(tài)不穩(wěn);3分:中度癱瘓但自主運(yùn)動(dòng)保存;4分:肢體嚴(yán)重癱瘓，自主運(yùn)動(dòng)不能;5分:瀕死狀態(tài)。

1．2 標(biāo)本采集與測(cè)定

1．2．1 標(biāo)本采集與處理 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取材，以10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，心臟取血后，取上清液用于ELISA檢測(cè);取大鼠脊髓腰膨大部位，部分以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋進(jìn)行免疫組化染色，部分組織迅速凍存于液氮中進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)。

1．2．2 脊髓RORγt染色 脊髓組織石蠟切片后，按免疫組化常規(guī)步驟進(jìn)行RORγt染色。一抗為兔抗大鼠RORγt，以1∶50稀釋，二抗為羊抗兔 IgG，三抗為辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液。以0．01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。胞漿棕褐色為陽(yáng)性染色。

1．2．3 ELISA 檢測(cè) IL－17、IL－6 水平 檢測(cè)均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值(A值)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算各樣本的值。

1．2．4 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)檢測(cè) IL－17和HO－1 mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑提取脊髓腰膨大組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)cDNA，以此為模板行熒光定量PCR擴(kuò)增。目的基因引物序列IL－17的上游引物:5'TCCATGTGCCTGATGCTGTTGC 3'，下游引物:5'AGTTATTGGCCTCGGCGTTTGG 3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度106 bp，退火溫度56℃。HO－1上游引物:5'CTCGCATGAACACTCTGGAGATG 3'，下游引物:5'TCTGTGAGGGACTCTGGTCTTTGT 3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度147 bp，退火溫度56℃;GAPDH作為內(nèi)參上游引物:5'CGTTGACATCCGTAAAGACCTTA 3'，下 游 引 物:5AAC－AGTCCGCCTAGAAGCACAAT 3'，產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度127 bp，退火溫度58℃。實(shí)時(shí)定量PCR儀分析比較IL－17、HO－1與 GAPDF的相對(duì)吸光度值并進(jìn)行半定量分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料多組比較應(yīng)用One－way ANOVA方差分析，組間比較采用SNK法，多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0．05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 臨床表現(xiàn)及神經(jīng)功能評(píng)分 動(dòng)物免疫后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、體重下降、皮毛不光滑，于免疫后第12天開(kāi)始出現(xiàn)尾部無(wú)力、后肢癱瘓、大小便失禁等表現(xiàn)，Edaravone組平均發(fā)病時(shí)間較EAE組明顯推遲(P＜0．01);Edaravone組發(fā)病率較EAE組下降(P＜0．05);對(duì)急性期臨床神經(jīng)功能評(píng)分，Edaravone組低于 EAE 組(P ＜0．05，見(jiàn)表1)。

2．2 脊髓RORγt表達(dá) 在脊髓組織可見(jiàn)炎癥細(xì)胞RORγt呈陽(yáng)性表達(dá)，并與炎癥程度呈正相關(guān)，Edaravone組各時(shí)期RORγt陽(yáng)性細(xì)胞減少，平均秩次均低于 EAE 組(P ＜0．05，見(jiàn)圖1)。

2．3 外周血IL－17、IL－6檢測(cè) EAE組炎癥因子IL－17外周血含量在發(fā)病急性期達(dá)高峰，隨疾病緩解降低(P＜0．05)，Edaravone組發(fā)病前期、急性期和緩解期 IL－17含量均低于 EAE組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P＜0．05)。前炎細(xì)胞因子IL－6則在發(fā)病前期含量最高，之后逐漸降低，Edaravone組IL－6均較EAE組各時(shí)間點(diǎn)含量下降，且在發(fā)病前期兩組比較差異有顯著意義(P ＜0．05，見(jiàn)表2、3)

表1 各組大鼠臨床發(fā)病情況比較Tab．1 Comparison of clinical situations in each group

圖1 不同時(shí)期大鼠脊髓RORγt表達(dá)(IHC，×400)Fig．1 Positive expression of RORγt in spinal cord in different group(IHC，×400)

表2 各組IL-17含量比較(x±s)Tab．2 The concentration of IL-17 in different groups(x±s)

表3 各組IL-6含量比較(x±s)Tab．3 The concentration of IL-6 in different groups(x±s)

2．4 脊髓組織中 IL－17mRNA和 HO－1mRNA表達(dá)EAE組炎癥因子IL－17mRNA表達(dá)在急性期最高，隨疾病好轉(zhuǎn)逐漸降低(P＜0．05)。Edaravone組各組IL－17mRNA表達(dá)低于 EAE 組(P＜0．05)。EAE組HO－1mRNA含量隨疾病進(jìn)展而增高(P＜0．05)，Edaravone組各時(shí)期 HO－1mRNA含量均高于 EAE組(P ＜0．05，見(jiàn)表4、5)。

3 討論

既往認(rèn)為MS及其動(dòng)物模型EAE都由Th1細(xì)胞介導(dǎo)。近年發(fā)現(xiàn)敲除Th1效應(yīng)因子IFN－γ的EAE小鼠比野生型EAE小鼠病情更嚴(yán)重。用IFN－γ抗體干預(yù)EAE，反而使其病情加重，說(shuō)明在EAE發(fā)病過(guò)程中，除了傳統(tǒng)認(rèn)為的Th1細(xì)胞參與致病外，可能還存在另外一類能誘導(dǎo)自身免疫的細(xì)胞亞群。

表4 各組IL-17 m RNA表達(dá)比較(x±s)Tab．4 The expression of IL-17 mRNA in different groups(x±s)

表5 各組HO-1 m RNA表達(dá)比較(x±s)Tab．5 The expression of HO-1 mRNA in different groups(x±s)

最近發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的細(xì)胞亞群，因分泌IL－17被命名為Th17細(xì)胞，由初始CD4+T細(xì)胞在TGF－β和IL－6的共同誘導(dǎo)下分化為Th17，RORγt是控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子［4］。Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)源于對(duì)EAE和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的研究，Th17細(xì)胞被證實(shí)能通過(guò)分泌炎癥介質(zhì)IL－17誘導(dǎo)嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)，缺失Th17細(xì)胞能防止或減輕EAE和CIA等自身免疫病的發(fā)?。?］。IL－17是一種重要的炎癥介質(zhì)，通過(guò)刺激其他細(xì)胞產(chǎn)生IL－6等促炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng)。它可以募集單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等髓樣細(xì)胞到炎癥部位，促進(jìn)局部炎癥環(huán)境的產(chǎn)生，許多研究表明IL－17在炎癥反應(yīng)中起到了重要的作用［6］。Kürtüncü 等［7］發(fā)現(xiàn)作為國(guó)際上公認(rèn)的治療MS藥物β干擾素(IFN－β)，其對(duì)MS早期的治療效果是通過(guò)調(diào)節(jié)Th17的免疫功能實(shí)現(xiàn)的。

IL－6在Th17細(xì)胞分化中起著十分關(guān)鍵的作用，在TGF－β單獨(dú)的作用下，活化的初始CD4+T細(xì)胞分化為具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，而在TGF－β和IL－6的共同誘導(dǎo)下分化為 Th17細(xì)胞，抑制了Treg細(xì)胞表達(dá)，從而介導(dǎo)機(jī)體的前炎癥反應(yīng)［8］。Korn 等［9］研究發(fā)現(xiàn) IL－6 缺陷(IL－6－/－)的基因敲除鼠，不能分化成Th17細(xì)胞，同時(shí)其未致敏T細(xì)胞主要分化為Treg細(xì)胞，Th17的分化受到抑制，表明IL－6在促進(jìn)炎癥反應(yīng)中有重要的作用。

RORγt特定表達(dá)于T細(xì)胞區(qū)域，在外周血中指導(dǎo)炎性Th17細(xì)胞的分化并調(diào)節(jié) IL－17的產(chǎn)量［10］。Ivanov等［11］研究認(rèn)為 TGF－β 和 IL－6 共同作用下先誘導(dǎo)未致敏的CD4+Th細(xì)胞表達(dá)RORγt，然后啟動(dòng)Th17細(xì)胞的分化并誘導(dǎo)基因IL－17的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

我們的實(shí)驗(yàn)表明外周血中IL－6在發(fā)病前期濃度最高，達(dá)到高峰，之后逐漸下降，早于IL－17達(dá)高峰;IL－17在發(fā)病前期濃度有所增高，在急性期達(dá)高峰，疾病緩解后降低，說(shuō)明IL－6作為前炎性細(xì)胞因子在疾病早期即迅速表達(dá)，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)IL－17的產(chǎn)生，在發(fā)病前期發(fā)揮促炎作用;而IL－17作為主要的炎癥效應(yīng)因子，與疾病發(fā)生發(fā)展程度一致，在疾病高峰期含量最高，導(dǎo)致組織損傷。有研究表明在EAE中Th17分泌的IL－17破壞血腦屏障，引起單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞趨化，效應(yīng)性T細(xì)胞沿著小靜脈向腦或者脊髓白質(zhì)浸潤(rùn)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥［12］。脊髓中RORγt陽(yáng)性表達(dá)的炎癥細(xì)胞數(shù)目隨疾病加重而增多，急性期數(shù)量最多，疾病好轉(zhuǎn)后逐漸下降，仍高于發(fā)病前期，與IL－17的變化是一致的，支持RORγt調(diào)控Th17細(xì)胞的分化及IL－17的生成。

HO－1是血紅素代謝途徑的限速酶，能催化血紅素轉(zhuǎn)變?yōu)槟懢G素、CO和游離鐵，可被氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)。以HO－1上調(diào)為表現(xiàn)的氧化應(yīng)激是脫髓鞘疾病中炎癥反應(yīng)的突出特征。HO－1及其催化產(chǎn)物主要保護(hù)細(xì)胞免受與炎癥和神經(jīng)變性疾病相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷［13］。Chora等［14］研究表明 HO－1 及其催化產(chǎn)物CO能夠減輕EAE發(fā)病，通過(guò)抑制Th細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞的聚集、增殖控制炎癥反應(yīng)，緩解疾病發(fā)生。Chen等［15］研究表明應(yīng)用紅細(xì)胞生成素EPO可以明顯減輕EAE發(fā)病程度，這種保護(hù)作用是通過(guò)誘導(dǎo)HO－1表達(dá)上調(diào)、調(diào)控免疫應(yīng)答，即抑制Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞，升高Treg細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。我們的研究顯示EAE大鼠發(fā)病后HO－1mRNA含量增加，明顯高于發(fā)病前期，并隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)持續(xù)增加，提示HO－1mRNA在炎癥發(fā)生后表達(dá)迅速增高，從而啟動(dòng)抗炎及抗氧化的雙重保護(hù)作用。

我們以Th17細(xì)胞為主軸，探討抗氧化劑Edaravone對(duì)MS治療作用及可能機(jī)制，研究表明應(yīng)用Edaravone治療EAE后，前炎細(xì)胞因子IL－6、轉(zhuǎn)錄因子RORγt及炎癥效應(yīng)因子IL－17的表達(dá)均有不同程度下降，而HO－1表達(dá)升高，提示Edaravone能夠起到抑制炎癥的作用。有研究表明HO－1可以表達(dá)在活化的Th17細(xì)胞上，通過(guò)抑制IL－6阻止Th17細(xì)胞的分化和活性［16］，提示Edaravone可能通過(guò)作用于HO－1同時(shí)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎的作用，從而降低動(dòng)物發(fā)病率，減輕臨床癥狀，推遲發(fā)病時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)為開(kāi)發(fā)治療MS的新藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究方向。

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