不明原因復發(fā)性流產與HLA-DQ相關性的初步研究①

吳彤華 朱元昌 尹 彪 李觀貴 陳文娜 陳春媚 曾 勇 梁佩燕 (深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心 深圳中山生殖與遺傳研究所 深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518000)

復發(fā)性流產(Recurrentmiscarriage，RM)是指臨床上連續(xù)3次或者3次以上妊娠終止于20周之前的自然流產，是一種常見的妊娠并發(fā)癥，發(fā)病率約為1% ～2%，病因十分復雜，除少數已知病因(如染色體核型異常、解剖結構異常、內分泌異常和TORCH感染因素等)外，大部分病因不明［1］，稱為不明原因復發(fā)性流產(Unexplained recurrentmiscarriage，uRM)，有越來越多的研究表明uRM的發(fā)生與母胎的免疫異常有關，母胎的免疫識別及免疫耐受被認為是維持妊娠的關鍵［2，3］。HLA 主要是識別“自我”與“非我”的大分子物質，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類分子，其中Ⅱ類分子尤其是HLA-DQ分子，與uRM之間的關系已成為研究熱點。DQ分子具有高度的多態(tài)性，uRM與DQ分子的關聯(lián)與人種特異性和區(qū)域分布有關［4］。當前大多數的學者只是關注女方DQ位點的易感性與uRM的關系，研究很少考慮男方DQ位點的作用，而胚胎是夫婦雙方遺傳信息的重新組合，有一半的遺傳信息來自于男方，因而男方作用不應被忽略。本實驗運用序列特異性引物 PCR(Sequence specific primer，SSP-PCR)和基因測序分型的方法(Sequence based typing，SBT)分析夫婦雙方HLA-DQA1和HLA-DQB1等位基因頻率和HLA的位點相容性，試圖從免疫遺傳角度探討uRM的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1．1 研究對象

1．1．1 不明原因復發(fā)性流產組 2010年2月 ～2012年6月就診于深圳中山泌尿外科醫(yī)院復發(fā)性流產與反復胚胎種植失敗診療中心25例不明原因復發(fā)性流產夫婦，年齡介于25～42歲，平均(32．77±4．71)歲，經檢測符合以下標準:夫婦雙方染色體核型正常，無家族遺傳性病史;經婦科、B超及子宮輸卵管造影檢查，排除生殖器解剖結構上畸形;內分泌(FSH、LH、PRL、HCG)各項指標正常，無糖尿病和甲狀腺功能亢進或者其他內分泌病史;無TORCH等病原體感染;自身抗體(抗磷脂抗體等)結果均為陰性。

1．1．2 對照組 與復發(fā)自然流產組同期就診行輔助生殖的16對夫婦，年齡介于26～40歲，平均(32.89±3．52)歲，女方各項檢查指標均正常，不孕原因單純由男方少弱精引起，經過卵胞內單精子注射-胚胎移植(Intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，ICSI-ET)治療后，16對夫婦均正常妊娠，且無自然流產，死胎，死產等發(fā)生。

1．2 實驗方法

1．2．1 DNA樣本的提取 EDTA-K2抗凝管采集夫婦雙方靜脈血2 ml，采用 Qiagen公司的 QIAamp DNA bloodmini kit提取全血DNA，DNA提取按照試劑盒說明書操作，樣本DNA保存于－20℃冰箱。

1．2．2 HLA分型檢測 采用 Invitrogen公司的HLA-DQ High Res Kit試劑盒檢測HLA-DQ的分型，過程如下:①PCR擴增，擴增反應體系和擴增條件按照試劑盒說明書操作;②HLA-DQA1采用SSPPCR方法進行分析;③HLA-DQB1采用SBT的方法進行分析。

1．3 統(tǒng)計學方法 夫婦雙方 HLA-DQA1、HLADQB1等位基因的頻率分布和匹配個數采用四格表χ2檢驗公式進行顯著性分析，計算各等位基因患病的相對危險率(Odds risk，OR)，OR=1，與疾病發(fā)生不相關;OR＞1，與疾病發(fā)生正相關，＞4時，表明與該種疾病強相關;OR＜1，與疾病發(fā)生負相關，具有保護性作用。P＜0．05表明差異具有統(tǒng)計學意義，以上統(tǒng)計均采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件。

2 結果

2．1 夫婦雙方HLA-DQA1和HLA-DQB1基因型的分布 uRM組夫婦雙方HLA-DQA1各位點等位基因頻率與對照組相比(見表1)，DQA1*01:02的基因頻率(28.13%vs12.00%)在男方中明顯下降，而HLA-DQA1*03:02的基因頻率(12.50% vs 22.00%)在女方中明顯升高，但差異無統(tǒng)計學意義。

表1 uRM組與對照組夫婦雙方HLA-DQA1等位基因的頻率分布Tab．1 Frequency of HLA-DQA1 alleles in coup les with uRM and in controls

表2 uRM組與對照組夫婦雙方HLA-DQB1等位基因的頻率分布Tab．2 Frequency of HLA-DQB1 alleles in coup les with uRM and in controls

uRM組夫婦雙方HLA-DQB1等位基因的分布頻率與對照組相比(見表2)，在女方中無統(tǒng)計學差異;在男方中，HLA-DQB1*03:01 升高(12．50%vs 32.00%，χ2=4．02，OR=3．29，P=0．045)，HLADQB1*05:02 降低(21．88%vs 4．00%，χ2=6．38，OR=0.149，P=0．025)，且差異具有統(tǒng)計學意義。

2．2 夫婦雙方HLA的相容性及HLA-DQB1第57位天冬氨酸的比較 uRM夫婦雙方HLA-DQ等位基因的匹配與對照組相比(見表3)，不同匹配個數之間有降低的趨勢，但差異尚不具有統(tǒng)計學意義。通過對比夫婦雙方HLA-DQB1第57位非天門冬氨酸(DQB1*02:01、DQB1*03:02、DQB1*05:01/05:02、DQB1*06:04/DQB1*06:05)與天冬氨酸的頻率分布(見表4)，無論在男方中還是在女方中兩者間的差異均沒有統(tǒng)計學意義(28．14% vs 32.00% ，P=0.81;21．25%vs 46．00%，P=0．25)。

3 討論

HLA復合體位于人類第6號染色體短臂上，長約4 000 kb，由一組緊密連鎖的復等位基因組成，是迄今為止人類已知最復雜的基因系統(tǒng)，約占人類基因組的1/3 000，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個區(qū)域，其中Ⅱ區(qū)基因在提呈抗原方面的作用較為重要，可分為DP、DQ、DR三個亞區(qū)，完整的DQ分子由DQA1基因編碼的α鏈和DQB1基因編碼的β鏈組成，具有高度的多態(tài)性，在引發(fā)特定的免疫反應中扮演重要的作用。當前，HLA-DQ與uRM之間的關系也成為研究熱點，主要集中在HLA-DQ的易感基因、易感單元體和夫婦雙方HLA-DQ分子的相容性等方面，但由于HLA-DQ分子種類的有限性和等位基因的高度多態(tài)性，不同等位基因之間連鎖的不平衡，區(qū)域的多變性和人種的多樣性等因素的影響，不同學者報道的結果差異較大，因而他們之間的關系迄今還不是很明確。

uRM的發(fā)生主要是由于母體免疫異常，引起母體對胚胎的免疫排斥和殺傷，從而導致流產的產生。胚胎是夫婦雙方遺傳信息的重新組合，胚胎的遺傳信息一半來自于母方，另一半來自于父方，母體通過免疫系統(tǒng)對胚胎進行識別，妊娠的繼續(xù)取決于母體對胚胎同種半異體抗原的識別，以及是否能“免疫耐受”父方的抗原。正常妊娠過程中父方的HLA抗原可以有效的刺激母體產生相應的抗體和多種有利于妊娠的細胞因子，這些相應抗體和細胞因子能有效的保護胚胎，避免母體對胚胎的攻擊，保護胚胎，維持妊娠的繼續(xù)。目前認為HLA主要是通過以下兩種途徑導致uRM的發(fā)生［5］:第一:母體特異性HLA位點，即母體自身存在一些疾病易感基因位點或者連鎖單元體，導致母體對胚胎抗原反應不足或過于強烈等不適當的免疫反應;第二:母胎雙方HLA-DQ抗原相容性增大，即母胎共享若干個共同抗原，胚胎與母體細胞表面抗原相似但又不完全相同，母體錯將胚胎視為外來細胞或自身“異常或腫瘤細胞”而殺傷胚胎，導致流產的發(fā)生。以上觀點特別是第一種觀點更多考慮是女方的因素而沒有考慮男方因素的作用，而妊娠是一個雙方遺傳信息的重新組合，因而男方的作用也不可忽略。本實驗將分別從雙方HLA-DQ等位基因易感性，夫婦雙方HLA-DQ位點的相容性以及DQB1第57位非天門冬氨酸的多態(tài)性等全面評估HLA-DQ與uRM之間的關系，進一步明確HLA-DQ分子在uRM發(fā)生中的作用。目前這類文獻主要集中在對女方的研究而對男方的研究較少見報道。

關于母體HLA-DQA1位點的易感基因報道較少，Dasgupta等［4］報道在高加索人群中DQA1*01:01和DQA1*05:01在RM患者中顯著增高，本研究結果表明HLA-DQA1所有位點的基因頻率與正常對照組相比沒有顯著的差異，盡管DQA1*03:02的頻率在夫婦雙方中，尤其是在女方中有較為明顯的升高，但沒有達到統(tǒng)計學差異。實驗結果也揭示了HLA-DQA1分子在uRM易感性方面不確定起著顯著的作用。

在HLA-DQ分子中，與RM的研究更多集中在DQB分子中，認為DQB在uRM發(fā)病中具有更加重要的作用，有大量文獻報道HLA-DQB1分子與uRM之間的相關性，例如DQB1*02:01、DQB1*03:03、DQB1*06:01、DQB1*06:04/DQB1*06:05 等［6-9］頻率在uRM患者中明顯升高，DQA1*02:01-DQB1*02:01、DQA1*01:01-DQB1*05:01、DQA1*05:01-DQB1*02:01單元型與uRM相關。本研究結果表明HLA-DQB1*03:01在夫婦中出現(xiàn)頻率都明顯升高，且在丈夫中達到統(tǒng)計學差異，揭示DQB1*03:01可能是導致uRM發(fā)生的易感基因。

Deschamps［10］在 Ⅰ 型糖尿病的研究中證實，HLA-DQB1β鏈第57位天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)若被其他氨基酸取代(丙氨酸、纈氨酸等)，則會影響與α鏈第76位或第79位堿性氨基酸的結合，引起HLA-DQB1空間結構改變，從而導致糖尿病的發(fā)生。為了了解β鏈第57位非Asp在uRM中的作用，本研究將uRM患者夫婦DQBβ鏈第57位Asp與非 Asp(DQB1*02:01、DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*05:02等)基因頻率與對照組進行比較，結果在uRM夫婦中并沒有發(fā)現(xiàn)β鏈第57位非Asp頻率增高，本研究結果提示HLA-DQB1β鏈第57位總的非Asp的基因型與uRM的發(fā)生沒有顯著的相關性，雖然有少數學者報道有一種或少數幾種非Asp基因型與uRM的發(fā)生相關，而大多數研究認為非Asp基因型與uRM的發(fā)生并沒有顯著的相關性，甚至個別等位基因是保護性基因，如本實驗結果揭示HLA-DQB1*05:02可能是一種保護性基因，與林其徳［11］報道的研究結果一致。

夫婦雙方的HLA-DQ位點的相容性一直是關注的焦點，有大量的文獻報道，夫婦雙方HLA的相容性增加會導致母體的免疫異常，產生一系列的妊娠并發(fā)癥如先兆子癇、RM等［12］，針對于雙方存在共同的HLA-DQ位點的夫婦進行丈夫淋巴細胞皮下注射，取得一定的臨床治療效果［13］;但也有不少學者提出質疑，認為兩者之間沒有明顯的相關性，即兩者的相容性增加或者降低與uRM的發(fā)生沒有必然的因果關系［14，15］。本實驗中uRM夫婦雙方HLADQ的相容性比例僅為32%，低于對照組的68.75%，實驗結果支持HLA-DQ的相容性與uRM發(fā)生之間沒有顯著的相關性。

綜上，HLA-DQ分子在uRM的發(fā)生中扮演著重要的作用，通過研究發(fā)現(xiàn)與uRM發(fā)生相關的等位基因，同時揭示夫婦雙方HLA位點的相容性與復發(fā)性流產之間沒有顯著的相關性，但實驗樣本量較小，需要后續(xù)進一步加大實驗樣本量進行證實，為臨床檢查提供更可靠的檢測指標。

1 Stephenson M D．Managementof recurrent early pregnancy loss［J］．JReprod Med，2006;51(4):303-310．

2 Guleria I，Sayegh M H．Maternal acceptance of the fetus:true human tolerance［J］．J Immunol，2007;187(6):3345-3351．

3 Jin L P，F(xiàn)an D X，Li D J et al．Regulation of costimulatory signal in maternal fetal immune tolerance［J］．Am JReprod Immunol，2011;66(2):76-83．

4 Dasgupta S，Meka A，Reddy BM etal．Genetic factors influencing recurrent pregnancy loss:lessons learnt from recent studies［J］．Expert Rev Obstet Gynecol，2012;7(4):363-378．

5 Stearns SC，Nesse R M，Govindaraju D R et al．Evolutionary perspectives on health and medicine ［J］． PNAS，2010;107:1691-1695．

6 何 淼，康 冰，廖世秀 et al．復發(fā)性流產與人類白細胞抗原DQB1基因多態(tài)性關系的研究［J］．中華婦產科雜志，2006;41(3):152-154．

7 Aruna M，Nagaraja T，Bhaskar S A et al．Novel alleles of HLA-DQ and-DR loci show association with recurrent miscarriages among South Indian women［J］．Hum Reprod，2011;26(4):765-774．

8 Shankarkumar U，Pawar A，Gaonkar P et al．HLA allele associations in idiopathic recurrent spontaneous abortion patients from India［J］．JHum Reprod，2008;1(1):19-24．

9 Lin Q D，Ma ZW ，Lu P H et al．Association of HLA-DQB1 coding region with unexplained recurrent spontaneous abortion［J］．Chin Med J，2004;17(4):492-497．

10 Deschamps I，Khalil I．The role of DQ alpha-bata heterodimers in genetic susceptibility to insulin dependent diabetes［J］．Diabetes Metab Rev，1993;9(2):71-92．

11 林其徳，陸佩華，汪希鵬et al．原因不明習慣性流產患者與人類白細胞抗原-DQ區(qū)域基因多態(tài)性的研究［J］．中華婦產科雜志，2001;36(5):293-295．

12 Koyama M，Saji F，Takahashi S et al．Probabilistic assessment of the HLA sharing of recurrent spontaneous abortion couples in the Japanese population ［J］．Tissue antigens，2008;37(5):211-217．

13 Liang P Y，Mo M L，LiGG etal．Comprehensive analysis of peripheral blood lymphocytes in 76 women with recurrent miscarriage before and after lymphocyte immunotherapy［J］．Am JReprod Immunol，2012;68(2):164-174．

14 Christiansen O B，Riisom K，Lauritsen JG et al．No increased histocompatibility antigen sharing in couples with idiopathic habitual abortions［J］．Hum Reprod，1989;4(2):160-162．

15 Wagenknecht D R，Green K M，John A et al．Analyses of HLA-DQ Alleles in recurrent spontaneous abortion(RSA)Couples［J］．Am JReprod Immunol，1997;37(1):1-6．