Ca2+對(duì)水楊酸誘發(fā)的丹參幼苗丹酚酸B生物合成的影響

曹蓉蓉，行冰玉，黨小琳，姚雅琴，劉連成，董娟娥

西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

丹參Salvia miltiorrhizaBunge是唇形科鼠尾草屬的多年生藥用植物，主要有效成分為酚酸類(lèi)和二萜醌類(lèi)化合物。丹酚酸 B (Salvianolic acid B, Sal B) 是丹參中的酚酸類(lèi)成分，由于其生物活性強(qiáng)、且在丹參中的含量高而被認(rèn)為是丹參酚酸類(lèi)成分中最主要的活性物質(zhì)之一[1]。Sal B具有很強(qiáng)的抗氧化能力 (能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，清除氧自由基)，對(duì)腦損傷及心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，還具有抗腫瘤和抗衰老作用[2]，這使丹參在中醫(yī)藥中的作用越來(lái)越受到人們的重視。研究表明，水楊酸可以促進(jìn)丹參懸浮細(xì)胞中丹酚酸B的生物合成[3]，ABA及其抑制劑也可以控制丹參毛狀根中丹酚酸 B的生物合成[4]。

水楊酸 (Salicylic acid，SA) 是植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性所必需的激素，可以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、種子萌發(fā)、果實(shí)形成和提高植物對(duì)抗外界不良環(huán)境脅迫的能力。SA作為誘導(dǎo)子能夠促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)物中次生代謝產(chǎn)物的合成及其相關(guān)合成酶基因的表達(dá)，如SA可以有效誘導(dǎo)茜草培養(yǎng)細(xì)胞中蒽醌[5]、發(fā)根假絲酵母中莨菪烷類(lèi)生物堿[6]、丹參培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B[7]的生物合成，乙酰水楊酸能夠誘導(dǎo)玫瑰培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生吲哚生物堿[8]。

Ca2+是植物細(xì)胞響應(yīng)多種刺激 (環(huán)境脅迫、激素、誘導(dǎo)子等) 反應(yīng)的重要第二信使，是植物響應(yīng)刺激應(yīng)答的中心調(diào)節(jié)子。Ca2+作為植物體內(nèi)重要的第二信使，信號(hào)的變化發(fā)生在生理反應(yīng)之前[9]。Ca2+對(duì)植物次生代謝物質(zhì)的積累也有非常重要的作用[10]，如SA誘導(dǎo)的蘿卜懸浮培養(yǎng)中幾丁質(zhì)酶增加的效應(yīng)與胞外Ca2+有關(guān)[11]，SA能引起酵母細(xì)胞質(zhì)游離 Ca2+升高，增加的鈣主要來(lái)自胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放[12]。leon研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高來(lái)自于胞外鈣離子的內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(kù)中鈣離子的釋放，胞內(nèi)鈣庫(kù)中的鈣離子發(fā)揮主要作用[13]。本課題組用外源 Ca2+處理丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同濃度的外源 Ca2+對(duì)丹參酚酸類(lèi)次生代謝物合成及其相關(guān)酶活性均產(chǎn)生了影響，推測(cè)胞外 Ca2+內(nèi)流可能參與了次生代謝物的生物合成[14]。但是在植株水平上，SA作為誘導(dǎo)子是否可以提高丹參幼苗丹酚酸B的合成積累量，以及SA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)、外的鈣離子是否參與丹參幼苗丹酚酸 B次生代謝物質(zhì)的生物合成還有待研究。

本研究以丹參幼苗為材料，用SA誘導(dǎo)，并用胞內(nèi)、外鈣離子通道抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑等藥理學(xué)試劑處理，檢測(cè)丹參保衛(wèi)細(xì)胞鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度和葉片中丹酚酸 B含量和關(guān)鍵酶活性的變化，探討鈣離子在水楊酸誘導(dǎo)丹參幼苗合成丹酚酸 B過(guò)程中的作用，為揭示誘導(dǎo)子誘發(fā)的鈣離子和次生代謝物質(zhì)之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丹參幼苗培養(yǎng)

將新鮮的丹參種子 (來(lái)源于陜西商洛丹參GAP藥源基地) 用自來(lái)水浸種24 h，然后置于濾紙或雙層紗布上，在25 ℃的溫室里培育待發(fā)芽。待種子發(fā)芽后移至營(yíng)養(yǎng)缽中培養(yǎng)。培養(yǎng)基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土 (購(gòu)自三力試劑公司)，培養(yǎng)條件為光光暗交替，光照 12 h/d，光照度為 400 μmol/(m2·s)，每隔1天用自來(lái)水澆灌。

1.2 水楊酸和藥理學(xué)試劑處理

水楊酸誘導(dǎo)：待丹參幼苗長(zhǎng)到50 d (約8~10片葉片，不包括子葉) 時(shí)，選取形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)、大小基本一致的幼苗，在葉面和葉背噴灑不同濃度的 SA (Sigma公司) 水溶液 (以噴清水為對(duì)照)，噴至葉片上藥液欲滴為止。分別在噴灑SA后的不同時(shí)間 (0、8、12、24、48和 72 h) 檢測(cè)丹酚酸 B含量，確定 SA適宜的誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度。

藥理學(xué)試劑處理：在水楊酸誘導(dǎo)前 60 min噴施藥理學(xué)試劑。分別噴施不同濃度的質(zhì)膜鈣通道抑制劑Verapamil (Vp，異搏定，Sigma公司)、LaCl3(上海山浦集團(tuán))、胞內(nèi)鈣調(diào)素拮抗劑Trifluoperazine (TFP，Sigma公司)、胞內(nèi)鈣通道抑制劑LiCl (Sigma公司)，以及抑制劑/拮抗劑的組合 Vp+LaCl3、TFP+LiCl，篩選出適宜的鈣離子抑制劑/拮抗劑濃度。根據(jù)前期試驗(yàn)篩選，Vp的處理濃度 250 μmol/L，LaCl3處理濃度為4 mmol/L，TFP處理濃度為200 μmol/L，LiCl處理濃度為4 mmol/L。

1.3 丹酚酸B的提取和含量檢測(cè)

丹酚酸 B的提取及含量檢測(cè)按照文獻(xiàn)的方法[15]。

樣品提?。菏斋@不同處理的丹參幼苗葉片，在47 ℃真空干燥箱中干燥至恒重。將干燥的葉片研碎成粉末，稱(chēng)取0.01 g左右置具塞試管中，用 70︰30 (V/V) 的甲醇-水溶液在超聲波提取器中提取45 min。提取液在8 000 r/min下離心10 min，上清液再用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后待檢測(cè)。

含量檢測(cè)：采用高效液相色譜法 (HPLC)，檢測(cè)條件進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化。色譜條件為：色譜柱，shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm i.d.5 μm)；流動(dòng)相，乙腈︰水︰磷酸 (體積比25︰75︰0.1)；流速，1 mL/min；進(jìn)樣量，10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)，285 nm；柱溫，25 ℃。

1.4 鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)

1.4.1 Fluo-3/AM探針的裝載

用DMSO配制FLUO-3/AM母液1mmol/l，用10 mmol/l的HEPES緩沖液 (Sigma公司) 稀釋母液到20 μmol/L，撕取丹參幼苗最上一對(duì)完全展開(kāi)葉的下表皮放入20 μmol/L的染料中，在4 ℃避光孵育2 h，取出后用HEPES洗2次。于室溫下再避光放置 2 h，在激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R) 下觀察。

1.4.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

將沖洗好的丹參葉片表皮條置載玻片上，蓋上兩塊蓋片，蓋片之間留有縫隙 (從此縫隙輕輕加入外源物，以保持表皮條不動(dòng))，用波長(zhǎng)488 nm的激光對(duì)葉片進(jìn)行斷層掃描，激光共聚焦顯微鏡觀察保衛(wèi)細(xì)胞中鈣離子熒光在不同層面上的分布，選取一個(gè)層面作為檢測(cè)對(duì)象。然后給載玻片加入2 mmol/L的SA，用Timecourse軟件記錄鈣離子熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化情況。在40×物鏡下采集圖像，Zoom 為 1.00×，每 30 s掃描一次并記錄一張照片，共掃描 15 min。參數(shù)為：Laser Wavelength，488.0；Laser Power，20.4；PMT HV，138；PMT Offset，0.

1.4.3 抑制/劑和水楊酸處理后Ca2+熒光觀察

FLUO-3/AM標(biāo)記完成后，于室溫下放置1 h，用抑制劑/拮抗劑處理，室溫放置1 h后，再用SA處理，用CLSM觀察Ca2+熒光強(qiáng)度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和顯著性檢驗(yàn)，用 photoshop軟件編輯圖片，Graphpad軟件進(jìn)行誤差分析。實(shí)驗(yàn)為單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。每次試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對(duì)丹參幼苗丹酚酸B生物合成的影響

分別用0.5、2.0、4.0 mmol/L的SA處理丹參幼苗，檢測(cè)丹參葉片丹酚酸B合成積累量，考察SA適宜的誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。結(jié)果如圖1所示。在SA處理前，對(duì)照組丹酚酸B的含量為(26.66±2.27) mg/g。SA處理后8 h丹酚酸B含量開(kāi)始上升，24 h達(dá)到最高值，之后逐漸下降。

在 SA處理的整個(gè)時(shí)期，丹酚酸 B含量均高于對(duì)照組，說(shuō)明0.5~4 mmol/L的SA均可促進(jìn)丹參幼苗丹酚酸B的合成。2 mmol/L的 SA在處理后 24 h丹酚酸 B含量達(dá)到(66.04±3.52) mg/g，是對(duì)照的1.97倍，也顯著高于其他處理組。說(shuō)明丹酚酸B的生物合成對(duì)SA的響應(yīng)具有濃度差異性。2.0 mmol/L的SA可在較短的時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)丹參幼苗合成較多的丹酚酸B，且對(duì)幼苗生長(zhǎng)沒(méi)有造成傷害 (數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中均以 2.0 mmol/L的 SA作為誘導(dǎo)子。

圖1 水楊酸處理對(duì)丹參幼苗丹酚酸B積累量的影響 (圖中不同的字母表示在5%水平差異顯著)Fig. 1 Effects of SA on the accumulation of Sal B in the leaves of S. miltiorrhiza. Different lowercases on the histongraphs with the different pattern indicate the significant differences (P<0.05).

2.2 SA處理對(duì)丹參保衛(wèi)細(xì)胞中鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

分別以未用 SA處理的裝載/不裝載鈣離子探針的材料作為對(duì)照，觀察SA誘導(dǎo)后丹參葉片保衛(wèi)細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果見(jiàn)圖2。每個(gè)處理每次觀察8~10個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。未裝載探針的丹參保衛(wèi)細(xì)胞有微弱的自發(fā)熒光(圖2C)。裝載鈣離子探針低溫孵育2 h但未施加SA的保衛(wèi)細(xì)胞里有明亮的綠色熒光 (圖 2A)。從 0~14 min，CK1和 CK2的保衛(wèi)細(xì)胞中持續(xù)為綠色熒光，而且強(qiáng)度幾乎不變。2 .0 mmol/L的SA處理后，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的熒光顯著增強(qiáng) (圖2B)。SA處理后的0~5 min，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光從微弱到紅色逐漸增強(qiáng)；處理后的6~9 min，維持較強(qiáng)的紅色熒光；處理后 10 min，紅色熒光開(kāi)始逐漸變?nèi)?，最后?4 min后幾乎消失。

圖2 SA處理對(duì)丹參葉片保衛(wèi)細(xì)胞中鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 A：CK1 (Fluo-3/AM處理)；B：SA處理；C：CK2 (無(wú)染料處理)；D：SA、CK1和CK2處理后的熒光強(qiáng)度變化；E：所采用偽彩的色階標(biāo)尺。深紫色代表熒光強(qiáng)度的最小值200，紅色代表最大值500. 圖片 (A、B、C) 右下角數(shù)字表示SA的處理時(shí)間 (min)Fig. 2 Effects of SA on the relative fluorescence intensity of Ca2+ in the guard cell of S. miltiorrhiza. (A) CK1(Fluo-3/AM treatment). (B) SA treatment. (C) CK2 (No Fluo-3/AM). (D) The detail intensity of SA、CK1 and CK2. (E)Color bar. Dark purple is minimum (200) and red is maximum intensity (500). Number given in the lower right of each graph (0-14) is the time after SA treatment (min).

從熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)來(lái)看 (圖 2D)，CK1和CK2的相對(duì)熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)變化微弱，鈣離子熒光強(qiáng)度均保持在200左右。SA處理后的6~7 min，丹參保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯升高 (相對(duì)熒光強(qiáng)度為 400左右)；處理后的 8.68 min，鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值(459.36)，隨后逐漸下降到 SA開(kāi)始處理時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度 (404)。說(shuō)明在受到外界SA刺激后，丹參保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迸發(fā)，維持一段 (較短) 時(shí)間后恢復(fù)。

2.3 鈣離子通道抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理對(duì)SA誘導(dǎo)的鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

分別施加胞外鈣離子通道抑制劑 Vp、LaCl3、胞內(nèi)鈣調(diào)素拮抗劑 TFP、胞內(nèi)鈣離子通道抑制劑 LiCl以及抑制劑組合 Vp+TFP、LaCl3+LiCl后，觀察SA誘導(dǎo)的鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化。抑制劑/拮抗劑均可明顯抑制 SA誘導(dǎo)的鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度 (圖3)。SA誘導(dǎo)后，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著上升，用胞內(nèi)、外抑制劑/拮抗劑單獨(dú)處理或者與 SA共處理后保衛(wèi)細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度均低于單獨(dú)用SA處理的熒光強(qiáng)度，說(shuō)明胞內(nèi)、外抑制劑/拮抗劑均抑制了 SA誘發(fā)的鈣離子迸發(fā)，丹參細(xì)胞內(nèi)、外的鈣離子均參與了SA誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員。

2.4 鈣離子通道抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理對(duì)SA誘導(dǎo)的丹酚酸B生物合成的影響

圖3 鈣離子通道抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理對(duì)水楊酸誘導(dǎo)的鈣離子熒光強(qiáng)度的影響 (A1，A2：胞外鈣離子通道抑制劑處理；B1，B2：胞內(nèi)鈣離通道子抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理；C1，C2：胞外抑制劑與胞內(nèi)抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑聯(lián)合處理)Fig. 3 Changes of relative fluorescence intensity of Ca2+ in S. miltiorrhiza guard cell in response to calcium channel inhibitors/calmodulin antagonist. (A1, A2) Extracellular calcium channel inhibitors Vp and LaCl3 treatment. (B1, B2)Intracellular calcium channel inhibitors LiCl /intracellular calmodulin antagonist TFP treatment. (C1, C2) Extracellular calcium channel inhibitors + intracellular calcium channel inhibitors/intracellular calmodulin antagonist treatment.

圖4 鈣離子抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理對(duì)SA誘導(dǎo)丹酚酸B生物合成的影響 (A：胞外鈣離子的作用；B：胞內(nèi)鈣離子/拮抗劑的作用；C：胞外、胞內(nèi)聯(lián)合作用) (圖中不同的字母表示在5%水平差異顯著)Fig. 4 Effects of Ca2+ channel inhibitors and intracelluar calmodulin antagonist on the accumulation of Sal B in S. miltiorrhiza. (A) Effects of extracellular calcium channel inhibitors. (B) Effects of intracellular calcium channel inhibitors/intracellular calmodulin antagonist. (C) Effects of extracellular calcium channel inhibitors +intracellular calcium channel inhibitors/intracelluar calmodulin antagonist. Different lowercases on the histongraphs with the different pattern indicate the significant differences (P<0.05).

先用篩選的適宜濃度的胞內(nèi)、外鈣離子抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理丹參幼苗葉片1 h后，再用適宜濃度的SA處理，考察抑制劑/拮抗劑處理后丹參幼苗葉片中丹酚酸 B的生物合成量。結(jié)果見(jiàn)圖4。SA誘導(dǎo)丹參幼苗葉片后，丹酚酸 B含量從 (12.81±0.86) mg/g提高到(22.78±3.46) mg/g，是對(duì)照的 1.78 倍 (P＜0.05)。抑制劑/拮抗劑與SA共同處理組丹酚酸B的含量均低于 SA處理組，而高于抑制劑/拮抗劑處理組。胞內(nèi)、外鈣離子抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑及其組合均對(duì)丹參葉片中丹酚酸 B的合成積累產(chǎn)生了顯著的抑制作用。

SA+Vp處理導(dǎo)致丹參葉片中丹酚酸B含量降低為SA處理組的29.53%；SA+LaCl3處理后，丹酚酸B含量降低為SA處理組的36.90%；SA+TFP處理后，含量降低為SA處理組的34.62%；SA+LiCl處理后，含量降低為 SA處理組的25.26%；SA和兩種抑制劑/拮抗劑聯(lián)合處理后，丹酚酸 B含量分別降低為 SA組的 15.91%、30.14% (P＜0.05)。

3 討論

鈣是植物體內(nèi)一種重要的第二信使[16]，主要介導(dǎo)許多刺激因子 (包括誘導(dǎo)子) 所引發(fā)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)程[17]。它通過(guò)把外源信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號(hào)，啟動(dòng)一系列胞內(nèi)生理生化反應(yīng)，發(fā)揮信號(hào)傳遞和放大的作用。這一信使功能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在正常情況下，鈣離子濃度一般維持在一定數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)，但在外界環(huán)境發(fā)生變化或是有外界刺激時(shí)，它的濃度會(huì)立即發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，用誘導(dǎo)子處理歐芹細(xì)胞后，2 min內(nèi)可出現(xiàn)Ca2+內(nèi)流增加[18]。水楊酸也可引發(fā)煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液Ca2+瞬時(shí)增加，且增加的鈣離子來(lái)源于外源鈣[19]。誘導(dǎo)子促進(jìn)長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞內(nèi)吲哚生物堿的合成與鈣離子的流入有極大的關(guān)系[20]。胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+釋放參與了殼聚糖誘導(dǎo)茜草細(xì)胞合成蒽醌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[21]。番茄保衛(wèi)細(xì)胞遇到外力、ABA或者是低溫時(shí)，胞內(nèi)和胞外鈣離子共同參與鈣離子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。用鈣離子抑制劑或拮抗劑處理，鈣離子濃度就會(huì)下降。如水楊酸處理引起植物胞質(zhì) Ca2+濃度增加，胞外 Ca2+螯合劑 EGTA、質(zhì)膜 Ca2+通道抑制劑 nifedipine和LaCl3均可減弱水楊酸的誘導(dǎo)效應(yīng)[23]，LiCl、Vp、nifedipine和TEA等會(huì)減少生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的小麥葉片原生質(zhì)體中鈣離子的濃度[24]。本實(shí)驗(yàn)中，SA誘導(dǎo)促使丹參保衛(wèi)細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(鈣濃度升高)，鈣迸發(fā)持續(xù)2~3 min，鈣離子抑制劑/拮抗劑抑制了水楊酸誘導(dǎo)的鈣迸發(fā)。說(shuō)明抑制劑/拮抗劑可以通過(guò)控制鈣離子通道或者是鈣調(diào)蛋白抑制胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。這與系統(tǒng)素引發(fā)的番茄葉肉細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員[25]和水楊酸誘導(dǎo)蠶豆氣孔運(yùn)動(dòng)[23]的研究結(jié)果一致。

水楊酸是一種有效的誘導(dǎo)子，被廣泛應(yīng)用于多種藥用植物以提高其次生代謝物的合成積累量。如水楊酸顯著提高了東莨菪中托品生物堿含量[26]、紅豆杉中紫杉烷和紫杉醇含量[27-28]、肉蓯蓉中苯乙醇苷合成量[29]、丹參細(xì)胞培養(yǎng)物中丹酚酸B含量[7]。本研究利用水楊酸處理丹參幼苗后發(fā)現(xiàn)，三種濃度的水楊酸均可促進(jìn)丹酚酸B的積累，而且丹酚酸B積累量在處理后24 h達(dá)到峰值。這與外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后丹參毛狀根中酚酸類(lèi)有效成分的研究結(jié)果類(lèi)似[30]。然而本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)水楊酸誘導(dǎo)丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸積累的結(jié)果表明，水楊酸處理后迷迭香酸合成的峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)后的8 h[15]，說(shuō)明丹參葉片和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)水楊酸誘導(dǎo)子的響應(yīng)有較大的差異，丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)水楊酸的響應(yīng)明顯快于葉片。

添加鈣離子抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理會(huì)使植物次生代謝物的含量下降。如在長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞合成吲哚生物堿時(shí)添加鈣離子通道抑制劑異搏定后，明顯降低了培養(yǎng)細(xì)胞中吲哚生物堿的含量[31]。LaCl3是質(zhì)膜鈣通道的一種無(wú)機(jī)類(lèi)抑制劑，能通過(guò)阻止 Ca2+的跨膜流動(dòng)而使其不能發(fā)揮信史作用，從而有效抑制誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的植物細(xì)胞或組織的防御反應(yīng)[31]。鈣調(diào)素拮抗劑TFP在有鈣離子參與的條件下能抑制CaM依賴(lài)的調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致靶酶不能被激活、次生代謝物質(zhì)無(wú)法形成[32]。LiCl作為IP3受體抑制劑，通過(guò)抑制 IP3門(mén)控的鈣離子通道來(lái)阻止鈣庫(kù)中鈣離子的釋放[33]。這些抑制劑/拮抗劑均可阻斷胞質(zhì)中鈣離子濃度的升高，并對(duì)植物次生代謝物質(zhì)的積累產(chǎn)生影響。本研究在利用鈣離子抑制劑/鈣調(diào)素拮抗劑處理后均使丹酚酸B的合成積累量顯著降低 (含量低于對(duì)照組和 SA誘導(dǎo)組)，抑制率可高達(dá)70%~80%。表明抑制劑/拮抗劑不僅抑制了水楊酸的誘導(dǎo)效應(yīng)，也抑制了正常幼苗合成丹酚酸 B。說(shuō)明水楊酸誘發(fā)的胞內(nèi)、胞外鈣離子均參與了丹參幼苗合成丹酚酸B的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。推測(cè)誘導(dǎo)子、鈣離子和次生代謝物質(zhì)之間存在如下關(guān)系：水楊酸誘導(dǎo)植物細(xì)胞質(zhì)膜或者液泡膜上的鈣離子通道打開(kāi)，胞內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+作為第二信使通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，使得細(xì)胞核編碼相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而合成次生代謝物質(zhì)。這一推測(cè)還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

水楊酸可以誘導(dǎo)丹參幼苗葉片保衛(wèi)細(xì)胞鈣離子迸發(fā)和丹酚酸 B合成積累量增加，胞外鈣通道抑制劑異搏定、LaCl3，胞內(nèi)鈣調(diào)素拮抗劑TFP、鈣通道抑制劑 LiCl均可抑制水楊酸誘導(dǎo)的丹參保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光增強(qiáng)和丹酚酸 B生物合成積累量增加，說(shuō)明水楊酸誘導(dǎo)的鈣離子迸發(fā)對(duì)丹參細(xì)胞中的丹酚酸 B生物合成起重要的調(diào)節(jié)作用。調(diào)節(jié)丹酚酸 B生物合成的鈣信號(hào)既包括胞外鈣離子的內(nèi)流，也包括胞內(nèi)鈣庫(kù)中鈣離子的釋放。

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