手足口病患兒體內淋巴細胞亞群和細胞因子水平變化及意義

張克昌，曹明杰，李維春，，徐元宏

(1滁州市第一人民醫(yī)院，安徽滁州239000;2安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院)

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、皰疹或潰瘍?yōu)橹饕卣鞯囊环N常見的小兒急性傳染病，少數(shù)患兒可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹、神經源性肺水腫、心肌炎等并發(fā)癥［1］。引起HFMD的病毒主要有柯薩奇病毒(CoxA組和CoxB組)、腸道病毒71型(EV71)和?？虏《镜?，其中以CoxA16和EV71最多見［2］。絕大多數(shù)HFMD患兒病情較輕、病程自限、病愈后皮膚不留任何痕跡，個別病例進展較快，尤其是EV71病毒感染引起的重癥病例，如出現(xiàn)神經系統(tǒng)癥狀，病死率極高。HFMD發(fā)生和發(fā)展過程中常伴隨著患者體內免疫學變化。本研究觀察了HFMD患兒淋巴細胞亞群、抗原遞呈細胞及細胞因子等免疫學指標變化，旨在為了解病情、療效觀察和預防并發(fā)癥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 我院2011年5～8月收治的115例HFMD住院患兒(HFMD組)，男72例，女43例;年齡4個月～8歲。均符合衛(wèi)生部辦公廳制定的《手足口病診療指南(2010年版)》診斷和病情評估標準，其中輕癥91例、重癥24例，均按上述指南進行治療。選擇20例體檢健康兒童為對照組，男12例，女8例;年齡3～7歲。兩組年齡、性別具有可比性(P ＞0．05)。

1．2 標本采集 按衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病預防控制指南》(2008年版)附件手足口病實驗室檢測方案(試行)，采集HFMD組入院時及重癥患兒治療后癥狀好轉時［一般為(8±2)d］外周血4 mL，置入干燥管和EDTA抗凝管中;對照組于查體時抽取等量外周血，同法保存。

1．3 淋巴細胞亞群及樹突狀細胞(DC)表面分子表達檢測 兩組均吸取50μL新鮮EDTA-K2抗凝全血，加入置有10 μL 熒光抗體(CD3、CD4、CD8、CD80、CD86、CD16/CD56、CD19)的專用試管中，混勻，室溫避光孵育15 min;每管加入1 mL溶血素，室溫避光孵育10 min;1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入生理鹽水500μL混勻后以流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8、CD16/CD56)、B 淋巴細胞(CD19)及DC表面分子(CD80、CD86)表達。所用儀器為BD FACSCalibur型流式細胞儀;試劑購于美國EB公司。

1．4 細胞因子濃度檢測 兩組均吸取2 mL新鮮EDTA-K2抗凝全血，采用ELISA法檢測血清IL-13、IL-10、轉化生長因子(TGF-β1)濃度。試劑盒購自美國R￡D公司，嚴格按照試劑盒使用說明書操作。同時常規(guī)檢查血常規(guī)和血糖、心肌酶譜、超敏C反應蛋白等生化指標。

1．5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，組間比較行方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

表1 兩組T淋巴細胞亞群表達陽性細胞比較(%±s)

表1 兩組T淋巴細胞亞群表達陽性細胞比較(%±s)

注:與對照組相比，#P ＜0．01

組別 n CD+3 CD+4 CD+8 CD+16/CD+56 HFMD組115重癥 24 29．967 ±14．269#15．346 ±8．598#15．946 ±7．849#8．842 ±6．260輕癥 91 42．280 ±15．577 21．456 ±9．102 20．423 ±6．233 10．366 ±6．224對照組 20 47．437 ±13．296 23．679 ±8．216 21．326 ±4．695 11．479 ±5．102

2．2 兩組DC及B淋巴細胞表面分子表達比較與對照組相比，HFMD組體內DC胞表面分子、比例明顯升高(P＜0．01)，而B淋巴細胞表面分子比例無明顯變化。見表2。

表2 兩組細胞表面分子陽性的DC及B淋巴細胞比較(% ± s)

表2 兩組細胞表面分子陽性的DC及B淋巴細胞比較(% ± s)

注:與對照組相比，★P ＜0．01

組別 n CD+80 CD+86 CD+19 HFMD組115重癥 24 2．562 ±0．783★ 3．424 ±1．064★ 20．013 ±12．724輕癥 30 2．613 ±0．873★ 3．441 ±1．553★ 22．600 ±13．784對照組20 0．634 ±0．291 1．242 ±0．493 25．842 ±12．780

2．3 兩組細胞因子水平比較 HFMD組重癥患兒血清 IL-13、IL-10、TGF-β1 水平顯著高于輕癥患兒及對照組(P＜0．05或0．01)，其中輕癥患兒 IL-10水平顯著高于對照組(P＜0．01)。詳見表3。

表 3 兩組細胞因子 IL-13、IL-10、TGF-β1 水平比較±s)

表 3 兩組細胞因子 IL-13、IL-10、TGF-β1 水平比較±s)

注:與對照組相比，★P ＜0．05，●P ＜0．01;與輕癥患兒相比，▲P ＜0．01

組別 n IL-13(ng/L) IL-10(ng/L) TGF-β1(μg/L)HFMD組115重癥 24 206．726 ±139．114★376．289 ±315．907●▲ 1．276 ±0．817★輕癥 42 112．101 ±106．660 218．407 ± 33．701● 0．593 ±0．576對照組20 93．864 ± 66．774 37．591 ± 14．984 0．642 ±0．755

2．4 HFMD組重癥患兒治療前后上述相關指標比較 HFMD組重癥患兒治療后、比例無明顯變化，而/明顯升高、/明顯下降(P＜0．05)，詳見表4;DC和B淋巴細胞表面分子比例均較治療前顯著升高(P＜0．05)，詳見表5;HFMD組重癥患兒治療前后血清IL-13、IL-10及TGF-β1濃度均無明顯變化，詳見表6。

表4 HFMD組重癥患兒治療前后體內淋巴細胞亞群表達陽性細胞比較(±s)

表4 HFMD組重癥患兒治療前后體內淋巴細胞亞群表達陽性細胞比較(±s)

注:與對照組相比，★P ＜0．05

組別 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+16/CD+56(%) CD+4/CD+8治療前 12 28．600 ±16．726 14．685 ±7．743 17．600 ±7．862 9．931 ±6．577 0．861 ±0．360治療后 12 35．746 ±15．908 18．723 ±8．074 16．815 ±8．708 4．392 ±4．323★ 1．294 ±0．428★

表5 HFMD組重癥患兒治療前后DC及B淋巴細胞表面分子表達陽性細胞比較(%±s)

表5 HFMD組重癥患兒治療前后DC及B淋巴細胞表面分子表達陽性細胞比較(%±s)

注:與對照組相比，★P ＜0．05

組別 n CD+80 CD+86 CD+19治療前12 2．136 ±0．782 2．765 ±1．356 19．123 ±13．574治療后 12 3．539 ±2．081★ 2．962 ±1．208★ 32．969 ±11．719★

表6 HFMD組重癥患兒治療前后細胞因子濃度比較(%±s)

表6 HFMD組重癥患兒治療前后細胞因子濃度比較(%±s)

組別 n IL-13(ng/L) IL-10(ng/L) TGF-β1(μg/L)治療前 12 275．117 ±139．295 471．000 ±317．880 1．624 ±0．781治療后 12 294．747 ±127．684 478．168 ±179．540 1．680 ±0．708

3 討論

研究證實，引起HFMD的病毒多為腸道單股正鏈RNA病毒，其能引發(fā)多種疾病，且傳染性很強。病毒感染后機體會發(fā)生一系列變化，抗原提呈細胞(Antigen presenting cells，APC)、淋巴細胞亞群以及體內多種細胞因子水平都會發(fā)生改變。正常人體的免疫狀態(tài)是在多種細胞及細胞因子的相互作用下保持平衡。外源性抗原進入機體后，一方面由活化的單核細胞、組織細胞、T細胞和巨核細胞釋放出趨化因子，可以吸引粒細胞、吞噬細胞等聚集吞噬并消化抗原，從而將抗原轉換成免疫原性多肽，以抗原肽-MHCⅡ分子復合物的形式表達于APC表面，供T細胞抗原受體(TCR)識別。內源性抗原被宿主細胞加工處理后以抗原肽-MHCⅠ類分子復合物的形式表達于T細胞表面，供特異性CD+8T細胞識別。T細胞經過雙識別活化后，可通過自分泌和旁分泌途徑分泌多種細胞因子對Th1和Th2細胞的分化進行調控，一方面通過分泌IL-4、IL-12等細胞因子，促進并放大免疫應答;另一方面也分泌IL-10、IL-13等細胞因子，對免疫強度進行調節(jié)，防止免疫應答過度亢進而損傷機體。上述過程同時也受到APC及NK細胞的調節(jié)［3］，過度活化的巨噬細胞可轉變成抑制性巨噬細胞，分泌前列腺素、TGF-β、活性氧分子等免疫抑制性物質，抑制免疫細胞活化、增殖和直接殺傷靶細胞。

CD分子是將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原歸為一個分化群(Cluster of differentiation，CD)，不同細胞表面的 CD分子參與不同的免疫應答過程。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的專職APC，能加工和提呈抗原，CD80(B7-1)、CD86(B7-2)是DC表面重要的共刺激分子，在抗原等物質的刺激下表達增強。本研究結果顯示，HFMD組體內 CD+80、CD+86表達水平明顯高于對照組。說明HFMD兒童的DC細胞活化功能正常，成熟DC遞呈抗原的能力進一步增強。T細胞通過TCR識別、捕捉由APC遞呈的抗原，并由CD3分子將活化的信號傳入胞內，借助CD4/CD8與MHCⅠ或Ⅱ 類抗原的相互作用，進一步鞏固APC與T細胞的結合，CD3可將TCR雙識別信號傳入T細胞內，促進T細胞活化，故CD3分布于所有活化T細胞表面。CD4+T細胞上的TCR可識別抗原肽-MHCⅡ類分子復合物，參與Th2細胞激活;CD8+T細胞可識別并結合MHCⅠ類分子，參與細胞毒性T細胞(CTL)激活。本研究結果顯示，與對照組相比，HFMD組外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞比例均明顯下降。說明HFMD患兒機體內活化的T淋巴細胞數(shù)量較少，免疫功能較低，使得病毒有浸入和發(fā)病的機會。此與石海礬等［4］研究結果相一致。本研究還顯示，HFMD重癥患兒經治療后活化T細胞比例雖有上升，但與治療前比較無明顯差異;CD+4/CD+8較治療前顯著升高。說明重癥兒童體質較差、免疫系統(tǒng)恢復較慢，也可能是采血時患者雖然癥狀有所緩解但免疫系統(tǒng)功能尚未完全恢復;治療后癥狀緩解時機體抵抗力正在恢復?；罨腄C還能通過分泌IL-12等多種途徑促進NK細胞活化及CTL活性，發(fā)揮殺傷功能［5，6］。/是活化 NK 細胞重要的表面分子。本研究顯示，兩組/表達無顯著差異。原因一方面可能是在APC通過胞膜接觸和分泌細胞因子途徑上調NK細胞活性，同時淋巴細胞和單核細胞分泌的IL-10、TGF-β等細胞因子下調其活性［7］，使得NK細胞活性總體表現(xiàn)無明顯變化。本研究還顯示，抑制性細胞因子IL-13、L-10、TGF-β濃度與HFMD病情輕重有明顯關系，重癥患兒顯著高于輕癥患兒高于對照。提示這些細胞因子參與了HFMD的發(fā)生與發(fā)展。本研究中重癥患兒治療前后細胞因子濃度雖無明顯變化，但治療后致炎性因素減少，對NK細胞的刺激作用下降，故NK含量下降、病情出現(xiàn)好轉。

HFMD患兒體內發(fā)生細胞免疫變化的同時也發(fā)生體液免疫變化。CD19是全部B細胞所共有的表面標志，B細胞活化后也不消失，是B細胞抗原受體(BCR)共受體復合物成員之一，參與 B細胞活化［8］。受病毒感染時，機體會發(fā)生類似變態(tài)反應的免疫學變化，初次接觸病毒時體內B淋巴細胞開始活化，胞內發(fā)生一系列分子生物學變化，如蛋白質和核酸合成增加，再次受到刺激上述B細胞開始分裂和分泌大量免疫球蛋白樣抗體，發(fā)揮體液免疫功能。本研究中兩組CD+19表達無顯著差異，但重癥患兒治療后顯著升高?？赡茉蚴荁細胞持續(xù)受到炎癥刺激發(fā)生增殖。同時部分B細胞也表達CD80，此可能是重癥患兒治療后CD8+0表達升高的原因(而非DC有所增加)，機制可能是抗原持續(xù)刺激、DC增殖減弱［9］。

總之，HFMD患兒體內存在細胞免疫和體液免疫狀態(tài)變化，正確認識和了解這些變化，對此類疾病的診治有極其重要的參考價值。

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