缺氧缺血性腦損傷對新生大鼠腎組織bcl-2、bax、fas、fasL 表達(dá)的影響

閆 睿，初桂蘭

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是指圍產(chǎn)期胎兒宮內(nèi)窘迫或出生后缺氧狀態(tài)延續(xù)導(dǎo)致的新生兒損傷，現(xiàn)認(rèn)為其帶來的危害已不僅僅局限于神經(jīng)系統(tǒng)，泌尿系統(tǒng)受累亦十分常見［1］。窒息缺氧時(shí)由于全身血液重新分布，導(dǎo)致腎臟血流進(jìn)一步減少，同時(shí)合并酸中毒則可使細(xì)胞受損出現(xiàn)腎損害，嚴(yán)重時(shí)甚至可能發(fā)生腎衰竭。國內(nèi)外都有臨床試驗(yàn)證實(shí)，HIBD患兒的血尿素氮和肌酐均較正常新生兒有所上升，而且尿酸和肌酐的比值也同時(shí)上升。甚至有報(bào)道指出，窒息新生兒腎損害發(fā)生率高達(dá)42%［2］?，F(xiàn)研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是器官功能障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。2011年3～9月進(jìn)行了此項(xiàng)研究，通過測定腎臟四種凋亡基因 bax、bcl-2、fas、fasL mRNA 的含量，探討HIBD對腎組織中細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響及其與缺氧時(shí)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物 新生7 d Wistar大鼠，生長條件相同，體質(zhì)量(15．2 ±3．1)g，雌雄不限，共 96 只，由天津市放射研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1．2 方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)分組 參照Rice等和國內(nèi)吳婉芳等的方法，建立新生大鼠HIBD模型。對照組只予分離但不結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，處理組結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，術(shù)后放回母鼠身邊恢復(fù)2 h。后置于2 500 mL密閉玻璃容器中，以1～2 L/min的速度輸入濕化的8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w(即缺氧處理)一段時(shí)間后處死;根據(jù)缺氧處理的時(shí)間將大鼠分為1、6、12、24、48、72 h 組(每組 8 只)，同時(shí)在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)設(shè)立對照組(即假手術(shù)組)。HIBD模型制備成功的指標(biāo)包括體質(zhì)量增長緩慢、左右腦重比值下降、行為能力障礙、病變側(cè)腦組織大體及顯微鏡下異常改變等。

1．2．2 測定指標(biāo)及方法 無菌條件下分離右側(cè)腎，迅速－180℃液氮冷凍處理，利用Trizol一步法(Invitrogen)提取 RNA，采用 RT-qPCR法測定組織中bcl-2、bax、fas、fasL 基因的表達(dá)量。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。各組數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，各相同時(shí)間點(diǎn)的對照組和處理組之間采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)的對照組和處理組間先進(jìn)行隨機(jī)分組設(shè)計(jì)資料的方差分析，如存在組間差異則進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較的q檢驗(yàn)。P≤0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 bcl-2基因 處理組均低于相應(yīng)對照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺血缺氧1 h為表達(dá)高峰(包括對照組和處理組)，其次為12 h，其余組別表達(dá)量不足上述兩組的1%，接近于零，其中24 h表達(dá)量最低。除1 h和12 h組外，其余時(shí)間點(diǎn)與對照組之間和處理組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 腎組織中bcl-2基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度±s)

表1 腎組織中bcl-2基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度±s)

組別 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P對照組 8 1．065 2 ±0．065 9 0．015 5 ±0．002 3 0．883 4 ±0．145 4 0．008 1 ±0．000 7 0．027 0 ±0．006 2 0．042 2 ±0．004 6 287．154 0．000處理組 8 0．816 9 ±0．017 6 0．006 4 ±0．000 1 0．592 7 ±0．037 9 0．005 9 ±0．000 1 0．008 4 ±0．000 2 0．016 6 ±0．000 2 2 299．491 0．000 t 8．137 8．724 4．325 6．937 6．681 12．308 P 0．000 0．000 0．003 0．000 0．000 0．000

2．2 bax基因 處理組均高于相應(yīng)對照組，1 h表達(dá)量均為最高，其中處理組表達(dá)量約為對照組的3倍，6 h最低，而后表達(dá)量隨時(shí)間延長而逐漸遞增，處理組的表達(dá)量均可達(dá)到對照組的2倍以上。對照組1 h和72 h表達(dá)量接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而同其他時(shí)間點(diǎn)組別相比則有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。處理組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 腎組織中bax基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度±s)

表2 腎組織中bax基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度±s)

組別 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P對照組 8 0．843 6 ±0．321 6 0．166 9 ±0．008 1 0．386 3 ±0．120 3 0．345 6 ±0．203 4 0．501 0 ±0．149 4 0．799 4 ±0．127 5 10．765 0．000處理組 8 2．430 2 ±0．056 0 0．261 4 ±0．013 6 0．806 5 ±0．008 2 0．927 2 ±0．015 1 1．125 0 ±0．025 1 1．384 4 ±0．018 8 3 458．789 0．002 t－10．868 －13．392 －7．793 －6．374 －9．21 －10．15 P 0．000 0．000 0．000 0．000 0．000 0．000

2．3 bcl-2/bax 相同時(shí)間點(diǎn)處理組比值低于對照組，12 h比值最高，其次為1 h。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對照組該比值大于1，處理組為0．1～1，與其他時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余時(shí)間點(diǎn)對照組比值集中在 0．03 ～0．09，處理組集中在 0．006 ～0．03，不同時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 腎組織中不同時(shí)間點(diǎn)的bcl-2/bax比值(ˉ±s)

表3 腎組織中不同時(shí)間點(diǎn)的bcl-2/bax比值(ˉ±s)

組別 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P對照組 8 1．462 5 ±0．665 5 0．092 9 ±0．016 1 2．535 0 ±1．164 9 0．032 5 ±0．021 9 0．062 6 ±0．040 7 0．053 3 ±0．006 3 18．6 0．000處理組 8 0．336 4 ±0．014 8 0．024 5 ±0．001 7 0．735 1 ±0．051 0 0．006 4 ±0．000 2 0．007 4 ±0．000 1 0．012 0 ±0．000 2 944．866 0．000 t 3．783 9．464 3．452 2．667 3．029 14．559 P 0．005 0．000 0．009 0．028 0．016 0．000

2．4 fas基因 1、6、12 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組表達(dá)量高于對照組，而在24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組表達(dá)量低于對照組，其中對照組的表達(dá)高峰出現(xiàn)在1 h，處理組的表達(dá)高峰出現(xiàn)在12 h，前期無論是對照組還是處理組(尤其以處理組更為明顯)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)后期，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 腎組織中fas基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度(±s)

表4 腎組織中fas基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度(±s)

組別 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P對照組 8 1．307 8 ±0．302 9 0．060 1 ±0．017 5 1．078 6 ±0．327 2 0．292 5 ±0．099 9 0．545 5 ±0．244 0 0．009 8 ±0．002 1 32．426 0．000處理組 8 2．190 1 ±0．060 4 0．169 0 ±0．001 8 2．882 7 ±0．003 3 0．029 6 ±0．000 7 0．128 5 ±0．001 6 0．042 7 ±0．000 9 13 437．5 0．002 t－6．388 －13．818 －12．329 5．883 3．821 －31．856 P 0．000 0．000 0．000 0．000 0．005 0．000

2．5 fasL基因 1、6 h處理組表達(dá)量高于對照組，1 h為處理組表達(dá)高峰，是同一時(shí)間點(diǎn)對照組表達(dá)量的10倍，其次為6 h，處理組表達(dá)較1 h明顯下降，約相當(dāng)于對照組的3倍，且為對照組表達(dá)最低點(diǎn)。其余時(shí)間點(diǎn)處理組表達(dá)量低于對照組。12 h為對照組表達(dá)高峰，余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量迅速下降，只相當(dāng)于12 h表達(dá)量的十分之一不到，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，處理組表達(dá)量接近于零。見表5。

表5 腎組織中fasL基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度±s)

表5 腎組織中fasL基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度±s)

組別 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P對照組 8 0．970 1 ±0．219 8 0．044 5 ±0．011 3 9．667 0 ±4．448 9 0．128 0 ±0．034 9 0．498 6 ±0．221 0 0．138 1 ±0．072 0 21．966 0．000處理組 8 10．094 0 ±0．076 38 0．117 0 ±0．003 3 2．783 7 ±0．020 4 0．029 1 ±0．000 7 0．035 8 ±0．000 4 0．062 8 ±0．001 6 77 512．3 0．002 t－87．685 －13．799 3．46 6．334 4．683 2．34 P 0．000 0．000 0．009 0．000 0．002 0．047

2．6 fas/fasL 6、12 h 處理組比值高于對照組，1、24、48、72 h低于對照組，其中6 h為最高值，其次為12 h，除12 h和24 h之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余組別差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，整體呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，在6 h達(dá)到比值最大，72 h比值最低，整體變化均勻，比值 0．2～1．5。72 h為對照組最高值，其次為24 h。除72 h外，其余組別之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比值集中在1～3，變化差異較小，整體要高于處理組。見表6。

表6 腎組織中不同時(shí)間點(diǎn)的fas/fasL比值(±s)

表6 腎組織中不同時(shí)間點(diǎn)的fas/fasL比值(±s)

組別 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P對照組 8 1．393 5 ±0．411 3 1．363 8 ±0．329 0 0．129 7 ±0．067 0 2．260 8 ±0．530 4 1．523 4 ±0．422 5 9．066 7 ±4．708 5 13．663 0．000處理組 8 0．217 0 ±0．005 0 1．445 9 ±0．005 4 1．035 6 ±0．008 6 1．018 5 ±0．033 5 0．454 8 ±0．006 8 0．086 0 ±0．002 5 2 069．122 0．000 t 6．396 －0．551 －29．986 5．226 5．655 4．265 P 0．000 0．597 0．000 0．001 0．000 0．003

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，新生7 d大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是不成熟的，其發(fā)育程度類似于孕32～34周的人類胎兒或新生兒，HIBD通常局限于頸總動脈結(jié)扎那一側(cè)的大腦半球，包括選擇性神經(jīng)元死亡和凋亡，大腦皮層、皮質(zhì)下及腦室周圍白質(zhì)、海馬、紋狀體及丘腦組織損傷［3］，但上述部位損傷后造成的其他器官功能改變研究尚不多見。本實(shí)驗(yàn)采用該模型，旨在研究HIBD對于腎的影響，結(jié)果表明該種損傷雖未直接作用于腎，但同樣可以促進(jìn)腎細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響機(jī)體代謝功能，影響預(yù)后。

新生兒窒息導(dǎo)致腎損傷機(jī)制:新生兒期腎血流量少，1周內(nèi)小兒腎血流量只占心排出量的8% ～12%(成人為25%)。由于新生兒腎單位發(fā)育未完善，腎小管發(fā)育比腎單位更差;窒息時(shí)全身血液重新分布，為保證心腦的血液供應(yīng)，腎臟等內(nèi)臟器官血管收縮，腎臟血流量減少，因此缺氧時(shí)腎功能更易受損［4］。同時(shí)缺氧使血栓素 A2產(chǎn)生增多，導(dǎo)致腎皮質(zhì)與髓質(zhì)血細(xì)胞聚集，體內(nèi)抗利尿激素、兒茶酚胺分泌增高，促使腎素釋放，繼而血管緊張素Ⅱ形成，導(dǎo)致腎動脈收縮，使腎血流灌注減少，腎臟發(fā)生缺血缺氧;加之缺氧時(shí)合并酸中毒，使細(xì)胞受損而出現(xiàn)腎損害，腎小球及腎小管受損，嚴(yán)重時(shí)可致腎小管壞死而發(fā)生急性腎衰。已有實(shí)驗(yàn)證明［5］，HIBD新生大鼠血尿素氮、肌酐較正常對照組均明顯升高，說明其腎功能明顯受損，與臨床報(bào)告一致［6］。這一過程中最先受到損傷的細(xì)胞是腎小管上皮細(xì)胞［7］，窒息后缺氧缺血使腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)水樣變性和空泡變性，腎小管管腔擴(kuò)張，管內(nèi)可見管型和壞死脫落細(xì)胞，少量腎小管腔內(nèi)有蛋白性液體積聚，間質(zhì)充血水腫大量炎細(xì)胞浸潤，管周血管明顯擴(kuò)張淤血。上皮細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)空泡樣變性。12～48 h細(xì)胞可以通過死亡配體與死亡受體、凋亡相關(guān)基因、氧化應(yīng)激、線粒體細(xì)胞色素C等多種途徑引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡和功能障礙［8，9］。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞生理性、自主性的死亡過程［10］。其中bcl-2與bax互為配體，fas與fasL互為配體。當(dāng)bcl-2與bax形成異二聚體時(shí)抑制凋亡，而bax強(qiáng)過量表達(dá)時(shí)則自身蛋白形成同源二聚體，促進(jìn)凋亡發(fā)生［11］。本研究顯示，對照組bcl-2始終高于處理組，說明HIBD抑制了抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)。但兩組的變化趨勢是相似的，即都在1 h表達(dá)量最高，其次為12 h，其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量小于本組上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的1%，這又提示HIBD對該基因的影響是較小的，沒有改變腎發(fā)育的一般軌跡。其表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)的驟然變化應(yīng)當(dāng)主要是受腎發(fā)育一般規(guī)律的作用，說明早期細(xì)胞增生活躍，抗凋亡作用較強(qiáng)，而后隨著時(shí)間的推移抗凋亡作用逐漸減弱。通過同一時(shí)間點(diǎn)不同組別的對比發(fā)現(xiàn)，6 h出現(xiàn)的表達(dá)低谷提示早期的bcl-2大量表達(dá)抑制了DNA的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，但該時(shí)間點(diǎn)處理組與對照組相比較1 h下降的更為明顯，可能是急性缺氧期引起了血流的重新分布，使得處理組抗凋亡基因表達(dá)急劇下降。而在12 h之后機(jī)體逐漸耐受缺氧，抗凋亡基因的表達(dá)量逐漸恢復(fù)，兩組的表達(dá)量差異較6 h縮小，48 h后HIBD造成的腎損害不可逆的加重，從而使處理組bcl-2下降明顯增加。bax在1 h表達(dá)量最高，6 h最低，而后表達(dá)量逐漸升高，各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。bax作為促凋亡基因，1 h屬于急性缺氧期，與抑凋亡基因一樣，該時(shí)段bax表達(dá)量相當(dāng)高，考慮屬于應(yīng)激反應(yīng)，即細(xì)胞活性增強(qiáng)，各種基因表達(dá)上調(diào);隨著缺氧時(shí)間的延長，該基因表達(dá)逐漸增加，凋亡越來越占主要地位。bcl-2/bax的比值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組均低于對照組，由于二者的比值更能準(zhǔn)確地預(yù)示凋亡的發(fā)生，我們可以推斷HIBD的確起到了促進(jìn)腎細(xì)胞凋亡的作用。該比值在12 h最高，其次為1 h，其他組別比值均顯著低于上述兩組。缺氧作為公認(rèn)的凋亡誘導(dǎo)的因素之一，在HIBD急性期并沒有促進(jìn)細(xì)胞凋亡，相反抗凋亡起到主導(dǎo)作用，揭示了器官對缺氧的耐受能力;而后期12 h抑凋亡基因再次大量表達(dá)，并使抗凋亡作用達(dá)到頂峰，考慮是隨著bax的大量表達(dá)激活了bcl-2基因，baxbcl-2蛋白結(jié)合緊密，不易降解，也就意味著需要大量新的bcl-2產(chǎn)生去結(jié)合新產(chǎn)生的bax，但是，隨著缺氧時(shí)間的延長，抑凋亡基因受到抑制，使腎臟細(xì)胞不可避免的發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致器官功能障礙。

fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由于膜fasL、抗fas-特殊的抗體和塊狀可溶的fasL的刺激引起的［12］。有研究用TUNEL法測得急性腎衰竭腎小動脈、腎小管及周圍區(qū)域的細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，凋亡小體與腎功能改變呈正相關(guān);同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示，fas/fasL在ARF腎組織的近曲小管、遠(yuǎn)曲小管周圍表達(dá)增加，提示fas/fasL途徑參與了腎小管上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而本研究也有相似的發(fā)現(xiàn)。處理組fas在12 h表達(dá)量最高，其次為1 h;與fas相似的是，處理組fasL在1 h表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他各組，其次為12 h，其他各組表達(dá)量極微，不足1%。考慮到fasL僅僅表達(dá)于活化的T細(xì)胞，可以說明腎臟在缺氧1 h時(shí)T細(xì)胞總數(shù)較多，通過與fas相作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，后受到缺氧抑制，表達(dá)量急劇下降。fas/fasL的比值是決定細(xì)胞發(fā)生凋亡與否的重要因素，早期的fas和fasL表達(dá)量及其比值在處理組均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對照組，說明HIBD早期(12 h以內(nèi))fas/fasL作為促進(jìn)凋亡發(fā)生的途徑之一與bcl-2/bax協(xié)同作用，共同促進(jìn)腎細(xì)胞的凋亡;而在后期fas和fasL及其比值在對照組反而要高于處理組，考慮到fasL只表達(dá)于活化的T細(xì)胞，通過與表達(dá)fas的靶細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，說明在缺氧的作用下腎組織內(nèi)活化的T細(xì)胞數(shù)量減少，表達(dá)fas的靶細(xì)胞由于前期的凋亡作用數(shù)量亦有所下降，因此整體表達(dá)量要低于對照組，此時(shí)只有bcl-2/bax途徑起到主要的促凋亡作用。

通過本實(shí)驗(yàn)，我們可以進(jìn)一步明確缺氧缺血性腦損傷不是單純的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其可促進(jìn)腎細(xì)胞的凋亡。通過本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的時(shí)間組來看，1～12 h是細(xì)胞發(fā)生凋亡的高峰期，因此，強(qiáng)調(diào)早期診斷、早期治療有著重要意義。不僅可以減少神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生，還可以降低由于細(xì)胞凋亡引起的腎功能受損程度，從而維持機(jī)體正常代謝，提高整體預(yù)后。

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