iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)在肺腺癌血漿生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

覃慧嬋，柳廣南，蘇 紅，張建全，傅鈺雁

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

原發(fā)性支氣管肺癌簡(jiǎn)稱肺癌，為最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率都有逐年增高的趨勢(shì)。目前，肺癌的臨床診斷主要依靠影像學(xué)(胸部X線片和CT)、細(xì)胞病理學(xué)(痰脫落癌細(xì)胞)和組織學(xué)(病理切片)等檢查。這些傳統(tǒng)的診斷方式雖在臨床上應(yīng)用多年，但往往不能早期發(fā)現(xiàn)肺癌，以致于80%肺癌患者在就診時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高肺癌生存率的關(guān)鍵。肺癌依據(jù)其病理類型分為兩大類:小細(xì)胞肺癌及非小細(xì)胞肺癌，而非小細(xì)胞肺癌又分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等;近年來，肺腺癌的發(fā)病率有不斷上升的趨勢(shì)，但其癌變機(jī)制仍不十分明確，尚缺乏有效的用于肺腺癌早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)是近年來開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，是一種理想的尋找生物標(biāo)志物的技術(shù)［1］，已被應(yīng)用于乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等血清標(biāo)志物的研究［2～4］。本研究旨在應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)篩選出用于診斷肺腺癌的血漿生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2011年9月～2012年9月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的肺腺癌患者10例(腺癌組)，男5例、女5例，年齡35～70(53．80±11．54)歲，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且均未行放療或化療;選擇同期健康體檢者10例(正常組)，男5例、女5 例，年齡30～70(52．36 ±10．17)歲。兩組研究對(duì)象在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0．05)，兩組血漿標(biāo)本獲得均經(jīng)過患者或家屬知情同意。

1．2 方法

1．2．1 血漿標(biāo)本的采集與保存 所有血漿樣品為清晨空腹時(shí)使用抗凝管采集，在4℃下以3 000g離心10 min，收集上清液，冰上分裝后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 去除血漿高豐度蛋白 兩組血漿樣品均進(jìn)行組內(nèi)等體積混合，然后按照Proteominer試劑盒的操作步驟去除血漿高豐度蛋白，并采用Brandford法測(cè)定蛋白含量;取 0．5μg/μL蛋白上樣，行 SDSPAGE，檢測(cè)樣品中高豐度蛋白的去除情況。

1．2．3 蛋白酶解及iTRAQ標(biāo)記 每組精確取出100μg蛋白，蛋白∶酶按20∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解4 h。按上述比例再補(bǔ)加1次Trypsin，37℃繼續(xù)酶解8 h。胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段;用0．5 mol/L TEAB復(fù)溶肽段，按照手冊(cè)進(jìn)行iTRAQ;兩組肽段被不同的iTRAQ標(biāo)簽標(biāo)記(正常組以113標(biāo)記，腺癌組以118標(biāo)記)后，室溫培養(yǎng)2 h。

1．2．4 SCX強(qiáng)陽離子交換柱分離蛋白 將標(biāo)記后的兩組肽段混合，采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)、分離柱為4．6 mm×250 mm型號(hào)的SCX柱對(duì)樣品進(jìn)行液相分離。將標(biāo)記后抽干的混合肽段用4 mL buffer A(25 mmol/L NaH2PO4，25%CN，pH 2．7)復(fù)溶。進(jìn)柱后以1 mL/min速率進(jìn)行梯度洗脫:先用buffer A洗脫10 min，再逐漸混入5% ～35%buffer B(25 mmol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl，25%ACN，pH 2．7)洗脫11 min，最后逐漸混入35% ～80%buffer B洗脫1 min。整個(gè)洗脫過程在214 nm吸光度下進(jìn)行監(jiān)測(cè)，經(jīng)過篩選得到20個(gè)組分。每個(gè)組分分別用StrataX除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干。

1．2．5 基于 Triple TOF 5600的 LC-ESI-MS/MS分析 與質(zhì)譜儀相結(jié)合的液相系統(tǒng)為nanoACQuity(Waters)，包括 Symmetry C18柱(規(guī)格 5 μm，180 μm ×20 mm)和 BEH130 C18柱(規(guī)格1．7 μm，100 μm×100 mm)兩部分。Symmetry C18柱用于肽段吸附和除鹽，BEH130 C18柱用于分離。所用的流動(dòng)相A液(水∶乙腈∶甲酸=98∶2∶0．1)和B 液(水∶乙腈∶甲酸=2∶98∶0．1)中都加入一定比例的校正液。每次上樣量為2．25μg(9μL)，用A液以2 μL/min的流速洗脫15 min，進(jìn)行肽段吸附和除鹽。接下來用含5%B液的流動(dòng)相以300 nL/min流速洗脫1 min，開始建立洗脫梯度:40 min內(nèi)B液梯度線型從5%升至35%，再5 min從35%升至80%，然后80%持續(xù)洗脫5 min，最后2 min恢復(fù)柱料。使用的機(jī)器為 TripleTOF 5600(AB SCIEX，Concord，ON)，離子源為 NanosprayⅢ source(AB SCIEX，Concord，N)，放射器為石英材料拉制的噴針(New Objectives，Woburn，MA)。數(shù)據(jù)采集時(shí)，機(jī)器的參數(shù)設(shè)置如下:離子源噴霧電壓2．5 kV，氮?dú)鈮毫?0 psi(14．5 psi≈1 bar)，噴霧氣壓 15 psi，噴霧接口處溫度150℃;掃描模式為反射模式，分辨率≥30 000;積累250 ms的從2+到5+的離子挑選其中強(qiáng)度每秒積累超過120分的前30個(gè)進(jìn)行掃描，3．3 s為1個(gè)循環(huán);第2個(gè)四極桿(Q2)的傳輸窗口設(shè)置為100 Da為100%;脈沖射頻電的頻率為11 kHz;檢測(cè)器的檢測(cè)頻率為40 GHz;每次掃描的粒子信號(hào)以4個(gè)通道分別記錄共4次后合并轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù);對(duì)于iTRAQ類項(xiàng)目，離子碎裂的能量設(shè)置為(35±5)eV;母離子動(dòng)態(tài)排除設(shè)置:在一半的出峰時(shí)間內(nèi)(約18 s)，相同母離子的碎裂不超過2次。

1．2．6 數(shù)據(jù)庫檢索及生物信息學(xué)分析 用Mascot 2．3．02蛋白質(zhì)鑒定軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫 IPI:homo(91464sequences)，V-3．87 進(jìn)行搜索，軟件依據(jù)同位素報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)含量進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，以報(bào)告基團(tuán)113為參照，選擇差異顯著(P≤0．05)的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。以比值＞1．50或＜0．67作為閾值選取差異蛋白。鑒定得到的蛋白進(jìn)行基因功能聚類分析(GO)及基因路徑分析。

2 結(jié)果

2．1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 質(zhì)譜共鑒定到蛋白369個(gè)，其中差異表達(dá)的蛋白有35種，腺癌組較正常組上調(diào)的蛋白有21種，下調(diào)的蛋白有14種。見表1。

表1 腺癌組與正常組比較上調(diào)比值＞1.50或下調(diào)比值＜0.67的蛋白

2．2 生物學(xué)功能分析 本研究對(duì)369個(gè)通過鑒定的蛋白進(jìn)行GO分析及pathway分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這369個(gè)蛋白分別參與了26個(gè)生物學(xué)過程，有18種分子功能，參與52個(gè)生物代謝通路。排名前3位的生物學(xué)過程為免疫與防御(13．6%)、發(fā)育過程(11．7%)、分子轉(zhuǎn)運(yùn)(9．4%)，分子功能為結(jié)合功能蛋白(15．7%)、催化功能蛋白(12．5%)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(9．3%)，生物代謝通路為炎癥信號(hào)通路(25．6%)、整合素信號(hào)通路(11．9%)、凋亡信號(hào)通路(5．7%)。

3 討論

肺腺癌多數(shù)起源于較小的支氣管，為周圍型肺癌，故早期一般沒有明顯的臨床癥狀，許多患者在就診時(shí)已喪失最佳治療時(shí)機(jī)。因此，越來越多的研究致力于尋找肺腺癌早期生物標(biāo)志物以助診斷，近年來，iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)已經(jīng)逐漸成為差異蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究的主要工具之一，廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、常見疾病差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定，有利于闡明疾病的發(fā)生機(jī)理，對(duì)疾病的預(yù)防、診斷、預(yù)后和療效監(jiān)測(cè)具有重要作用，并有助于用作靶點(diǎn)來開發(fā)臨床治療藥物。

iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)在肺腺癌的研究方面已取得一定的成果。Chuncg等［5］應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)篩選12例肺腺癌及癌旁正常組織的差異蛋白，并應(yīng)用免疫組化的方法進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)AGR2有望成為肺腺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物。Keshamouni等［6］應(yīng)用 iTRAQ 聯(lián)合 LC-MS/MS 技術(shù)鑒定出了腫瘤壞死因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞株A549上皮間葉轉(zhuǎn)化的相關(guān)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了許多與細(xì)胞遷移、黏附和浸潤(rùn)作用有關(guān)的蛋白質(zhì)。張薇等［7］應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合LC-MS/MS方法篩選肺腺癌細(xì)胞株、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和人正常支氣管上皮細(xì)胞株的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)HSP90和波形蛋白有望成為肺腺癌的候選腫瘤標(biāo)志物。

本研究采用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)篩選肺腺癌組與正常組血漿差異蛋白，共鑒定差異表達(dá)的蛋白有35種，腺癌組較正常組上調(diào)的蛋白有21種，下調(diào)的蛋白有14種，其中，SCGB3A2、SFTPB表達(dá)顯著上調(diào)。SCGB3A2又稱子宮珠蛋白相關(guān)蛋白1(UGRP-1)，在免疫調(diào)節(jié)和抗炎活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此SCGB3A2的表達(dá)水平可能對(duì)疾病的診斷及預(yù)后效果的評(píng)價(jià)有一定的指導(dǎo)作用。目前，關(guān)于SCGB3A2在肺腺癌方面的研究甚少Kurotani等［8］通過免疫組化的方法檢測(cè)到SCGB3A2在肺腺癌患者中高表達(dá)，提示SCGB3A2有望成為肺腺癌的生物標(biāo)志物;而國(guó)內(nèi)尚未見SCGB3A2在肺腺癌研究方面的報(bào)道。本研究中發(fā)現(xiàn)SCGB3A2在肺腺癌組血漿中的表達(dá)顯著高于正常組，說明SCGB3A2在肺腺癌的癌變過程中起一定作用，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

SFTPB即表面活性蛋白B，主要由肺泡Ⅱ型細(xì)胞合成和分泌，是肺表面物質(zhì)形成所必需的物質(zhì)，與肺的發(fā)育過程密切相關(guān)，其遺傳缺陷與NRDS、急性呼吸窘迫綜合征、先天性肺泡蛋白沉積癥、成年慢性阻塞性肺氣腫等呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)聯(lián)。Sumita等［9］研究發(fā)現(xiàn)，SFTPB基因敲除小鼠和SFTPB基因突變新生兒出生后死于呼吸窘迫。而SFTPB表達(dá)與肺腺癌是否存在關(guān)聯(lián)，國(guó)內(nèi)外僅有幾篇報(bào)道，Xi等［10］研究發(fā)現(xiàn)，SFTPB在肺腺癌及肺鱗癌組織中表達(dá)均增高。本研究發(fā)現(xiàn)SFTPB在肺腺癌組血漿中表達(dá)明顯高于正常組，提示SFTPB在肺腺癌的發(fā)病中可能發(fā)揮作用。

總之，本研究應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)能很好地進(jìn)行了肺腺癌的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，能一次性篩選出35種與肺腺癌相關(guān)的差異蛋白，并能對(duì)其進(jìn)行定性及相對(duì)定量;對(duì)篩選出的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，還能了解其參與的生物學(xué)過程及代謝通路等，為肺腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的線索;本研究中篩選出的表達(dá)有顯著差異的蛋白SCGB3A2、SFTPB有望成為潛在的肺腺癌血漿生物標(biāo)志物，值得進(jìn)一步研究。

［1］ Melanson JE，Avery SL，Pinto DM．High-coverage quantitative proteomics using amine-specific isotopic labeling［J］．Proteomics，2006，6(16):4466-4474．

［2］Bouchal P，Roumeliotis T，Hrstka R，et al．Biomarker discovery in low-grade breast cancer using isobaric stable isotope tags and two-dimensional liquid chromat ography-tandem mass spectrometry(iTRAQ-2DLC-MS/MS)based quantitative proteomic analysis［J］．J Proteome Res，2009，8(1):362-373．

［3］Glen A，Gan CS，H amdy FC，et al．iTRAQ-facilitated proteomic analysis of human prostate cancer cells identifies proteins associated with progression［J］．J Pr oteome Res，2008，7(3):897-907．

［4］ DeSouza L，Diehl G，Rodrigues MJ，et al．Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cIC AT with mul tidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry［J］．JProteome Res，2005，4(2):377-386．

［5］Chung K，Nishiyama N，Wanibuchi H，et al．AGR2 as a potential biomarker of human lung adenocarcinoma［J］．Osaka City Med J，2012，58(1):13-24．

［6］ Keshamouni VG，Michailidis G，Grasso CS，et al．Differential protein expression profiling by iTRAQ-2DLC-MS/MSof lung cancer cells undergoing epithelial-mesenchymal transition reveals a migratory/invasive phenotype［J］．J Proteome Res，2006，5(5):1143-1154．

［7］張薇，楊拴盈，李維，等．肺癌細(xì)胞系和正常人支氣管上皮細(xì)胞系線粒體差異表達(dá)蛋白質(zhì)的定量研究［G］．第十二次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2011:132．

［8］Kurotani R，Kumaki N，Naizhen X，et al．Secretoglobin 3A2/uteroglobin-related protein 1 is a novel marker for pulmonary carcinoma in mice and humans［J］．Lung Cancer，2011，71(1):42-48．

［9］Sumita Y，Sugiura T，Kawaguchi Y，et al．Genetic polymorphisms in the surfactant proteins in systemic in Japanese:T/Tgenotype at 1580C/T(Thr131Ile)in the SP-P gene reduces the risk of interstitial lung disease［J］．Rheumatologyy，2008，47(3):289-291．

［10］Xi L，Coello MC，Litle VR，et al．A combination of molecular markers accurately detects lymph node metastasis in non-small cell lung cancer patients［J］． Clin Cancer Res，2006，12(8):2484-2491．