廣西紅水河流域壯族長壽家系子女ACAT1 rs1044925基因多態(tài)性與血脂水平的相關性

宋 臻，呂澤平，羅 桓，潘尚領，胡才友，楊 銘，杜麗麗，彭均華，羅曉秋，周小玲，尹瑞興，劉承武

(1廣西醫(yī)科大學病理生理學教研室，南寧530021;2廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院;3廣西醫(yī)科大學心血管研究所)

膽固醇?；D移酶(ACAT)是細胞內催化膽固醇和長鏈脂肪酸合成膽固醇酯的酶［1］，存在ACAT1和ACAT2。ACAT1在人體各種組織和細胞中廣泛表達，主要作用是維持細胞內外膽固醇的平衡［2，3］;ACAT2目前發(fā)現(xiàn)只在小腸和肝臟中表達，主要參與膽固醇的吸收和極低密度脂蛋白(VLDL)的裝配［4，5］。目前研究發(fā)現(xiàn)，ACAT 與動脈粥樣硬化及阿爾茨海默病等老年病的發(fā)生密切相關［6］。文獻報道，ACAT1 rs1044925的多態(tài)性可以影響血脂水平［7］。廣西紅水河一帶因長壽老人眾多，稱為廣西紅水河流域長壽帶。2010年12月～2012年7月，我們對采集的樣本進行相關研究，旨在探討該流域壯族長壽家系子女ACAT1 rs1044925基因多態(tài)性與血脂水平的關系，了解ACAT1基因在長壽人群中的作用。

1 資料與方法

1．1 研究資料 廣西紅水河流域壯族長壽家系第1代子女473例，年齡51～72歲;第2代子女311名，年齡31～50歲。同一地區(qū)壯族非長壽家系對照組年齡段同上，分別是346例和213例。采樣前排除冠心病、糖尿病、老年癡呆等老年相關性疾病。長壽家系指家庭成員中至少有1名年齡≥90歲老人，非長壽家系指家庭成員3代內無超過90歲老人。上述研究對象均知情同意參加該項研究。

1．2 方法

1．2．1 標本采集及處理 抽取研究對象空腹12 h晨起肘靜脈血8 mL，其中3 mL用ACD抗凝處理，以常規(guī)酚/氯仿法提取白細胞中基因組DNA，紫外分光光度法測定DNA含量，－20℃保存;另外5 mL分離血清，用于檢驗血脂、血糖水平。

1．2．2 ACAT1 rs1044925多態(tài)性檢測 采用 PCRRFLP法。上游引物序列:5'-TAT ATT AAG GGG ATC AGA AGT-3'，下游引物:5'-CCA CCT AAA AAC ATA CTA CC-3'(中國上海生工公司合成)，20μL PCR反應體系含有 DNA 0．5μg，上下游引物各0．2 μmol/L，dNTP 200 μmol/L，10 × PCR 緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8．3，500 mmol/L KCl，20 mmol/L MgCl2)2．0 μL 和 Taq多聚酶 1．0 U。PCR擴增條件:95℃預變性5 min;95℃變性45 s，53℃退火30 s，72℃延伸50 s，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物5μL在3．0%的瓊脂糖凝膠電泳30 min，并在紫外燈下觀察目的產(chǎn)物(389 bp)。10μL酶切體系含有PCR產(chǎn)物5μL、RsaI(NEB公司)5 U和10×NEB緩沖液1μL將酶切體系在37℃水浴箱內酶切過夜(＞8 h)，酶切產(chǎn)物電泳(條件同上)，并鑒定。

1．2．3 一般指標及血脂測定 流行病學調查血壓、身高、體重等，并計算身體質量指數(shù)(BMI)。血脂水平在廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院檢驗科檢測。血清TC、TG水平測定采用酶方法，HDL和LDL采用酶聯(lián)免疫一步法，試劑盒均購自中國上海申能試劑公司。血脂檢測的參考正常值:TC:3．10～5．17 mmol/L，TG:0．56 ～1．70 mmol/L，HDL-C:0．91 ～1．81 mmol/L，LDL-C:2．70 ～3．20 mmol/L。

1．2．4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19．0統(tǒng)計軟件。計量資料以ˉx±s表示，基因頻率用直接計數(shù)法計算;Hardy-Weiberg平衡檢驗采用擬合優(yōu)度χ2檢驗，樣本均數(shù)比較采用協(xié)方差分析(ANCOVA)，ANCOVA分析以消除年齡分布差異的影響，分類資料組間比較采用χ2檢驗，以P≤0．05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2．1 PCR結果 基因型AA只出現(xiàn)389 bp片段，基因型AC出現(xiàn)3個片段分別是389 bp、279 bp和110 bp，基因型CC出現(xiàn)2個片段分別是279 bp和110 bp。見圖1。

圖1 ACAT1 rs1044925酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖

2．2 基因型分布 隨機抽取部分樣本行DNA序列測定(中國上海生工公司)，結果與基因分型一致，表明分型結果穩(wěn)定可靠。見圖2。長壽家系各年齡段子女與對照組之間的等位基因和基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均＞0．05)。

2．3 一般情況及血脂水平比較 長壽家系子女的收縮壓(133．82 ±19．33)mmHg，TC(5．04 ±0．91)mmol/L，LDL(2．77 ±0．82)mmol/L，對照組分別為(131．55 ±19．72)mmHg、(4．87 ±0．95)mmol/L 和(2．60 ±0．85)mmol/L，P ＜0．05;第 1 代子女與對照組在收縮壓、舒張壓、TC、TG、LDL水平上比較差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0．05);長壽家系第2代與對照組比較LDL水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，其余指標差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0．05)。

2．4 ACAT1 rs1044925基因型對血脂水平的影響因CC基因型的個體很少，故與AC合并后再與野生純合型AA比較。結果顯示，廣西紅水河流域長壽家系子女中等位基因C攜帶者TC水平為(5．17±0．88)mmol/L，高于不攜帶者的(5．00 ± 0．92)mmol/L(F=5．073，P ＜0．05);分層后比較得出，長壽家系第2代子女組中攜帶等位基因C的個體TC水平(5．22±0．93)mmol/L比不攜帶者(4．98±0．96)mmol/L 也有更高(F=4．276，P ＜0．05)，第 1代子女中血脂與基因型比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);非長壽家系子女中，除了第1代子女組中攜帶等位基因 C的個體HDL水平(1．80±0．37)mmol/L比不攜帶者的(1．67±0．42)mmol/L均更高(F=6．526，P ＜0．05)外，其余組間基因型和血脂之間比較差異則無統(tǒng)計學意義(P均＞0．05)。

3 討論

廣西紅水河流域巴馬地區(qū)以長壽著稱，因此我們對本地區(qū)長壽壯族家系子女的一般情況進行了研究。本次研究結果得出，該地區(qū)長壽家系長壽老人子女的收縮壓、TC、LDL水平均高于對照組，分層后發(fā)現(xiàn)第1代子女血壓、TC、TG、LDL水平均高于對照組，而第2代子女除了LDL水平高于對照組外，其余指標差異無統(tǒng)計學意義。這與Vaarhorst小組［8］研究的萊頓長壽人群子女有低的TG水平不同，和Barzilai等［9］研究的長壽子女血脂水平也不一致。長壽是基因和環(huán)境多因素產(chǎn)生的結果，不同的長壽人群在長壽機制上存在一定特異性。廣西紅水河流域特殊的地理環(huán)境、飲食和文化背景，可能是導致長壽家系擁有高的血脂水平但長壽的原因所在。

ACAT1基因位點rs1044925突變存在明顯的種族差異，據(jù)文獻報道，國內外主要群體突變C等位基因頻率存在差異。Wollmer等［10］研究的中部和南部歐洲人的突變頻率是35．4%;Wu等［7］研究的中國廣西白褲瑤族的突變頻率是21．0%，明顯高于本次研究壯族長壽子女的突變頻率的11．7%和12．7%，與我們研究結果一致的有 Wu等［7］報道廣西南丹漢族人群突變頻率是12．7%。本次研究結果顯示，長壽子女組與對照組的基因型和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0．05)，這與趙發(fā)國等［11］研究的中國漢族北方正常人群和阿爾茨海默病人群的突變頻率(分別是9．7%、9．3%)及李琴等［12］研究的中國漢族成都地區(qū)健康人群和高脂血癥人群的突變頻率(分別是13．7%、15．3%)均無差異性一致。這表明該基因位點對長壽影響較小，突變頻率的可能與不同和種族、地域、飲食、文化等多因素有關。

高血脂是導致冠心病、腦卒中、糖尿病等老年性疾病的重要危險因素，進而可影響人類壽命。ACAT1在調節(jié)機體膽固醇酯代謝中的起著重要作用。到目前為止，國內外報道的ACAT1多態(tài)性位點最常見的有 3個，分別是 R526G、-77G＞A、rs1044925。Ohta等［13］報道的日本人群中R526G的變異不會影響血脂水平，而-77G＞A的變異個體有更高的 HDL-C和 ApoA1水平;相比而言，位點rs1044925對血脂的影響不同實驗室得出結果不一。本次研究結果顯示，對照組第1代子女中等位基因C攜帶者比不攜帶者有更高的HDL水平，這與Wu等［14］研究的高脂血癥患者男性等位基因C攜帶者比不攜帶者有更高的HDL水平一致，不同于李琴等［12］報道的中國漢族內源性高甘油三酯血癥患者AA基因型攜帶者比C等位基因攜帶者有更高的HDL-C水平和Wu等［14］報道中國廣西白褲瑤族女性等位基因C攜帶者有更低的TC、LDL-C水平。而本次研究的長壽總人群和分層后第2代子女中等位基因C攜帶者比不攜帶者則有更高的TC水平，和上述研究群體的結果均不一致，血脂水平受多種因素影響，不同的地理環(huán)境、飲食和生活習慣對血脂也有極大影響。廣西紅水河流域巴馬地區(qū)自古以來以長壽著稱，特殊的地理環(huán)境、飲食和生活習慣可能是造成研究結果的特殊性的原因所在，需要我們進一步加大樣本數(shù)量、多因素綜合分析以及增加多重對照是我們后續(xù)研究的方向。

綜上所述，ACAT1 rs1044925多態(tài)性與廣西紅水河流域壯族長壽家系子女無相關性，但是此基因多態(tài)性可以影響血脂水平，可能通過影響血脂水平來影響人類壽命。

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