HPV 感染與P53 在食道癌患者中的表達(dá)意義及臨床觀察

王斌

(天津市第四中心醫(yī)院胸心血管外科，天津 300140)

食道癌(esophageal cancer)，是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤［1］，我國是食道癌高發(fā)國家，也是食道癌死亡率最高的國家［2］。其發(fā)病因素目前還不明確，研究表明，食道癌發(fā)生與環(huán)境、飲食、遺傳、不良生活習(xí)慣、遺傳等因素關(guān)系密切，是多種因素同時(shí)作用的結(jié)果［3］。隨著病毒學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病毒性感染與食道癌的疾病相關(guān)性越來越受到廣大醫(yī)生的重視［4］。目前，關(guān)于HPV 和P53 與食道癌的疾病相關(guān)性的研究較少［5］。本研究應(yīng)用免疫組化(ELISA)方法，對(duì)食道癌組織和食道良性腫瘤組織及正常食道組織中的HPV 和P53 進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其與食道癌的疾病相關(guān)性進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008 年11 月至2012 年12 月本院胸外科住院食管癌手術(shù)患者的食管組織85 例，其中食管癌組織45 例，食管良性腫瘤組織20 例，正常食管組織(取自良性腫瘤瘤旁組織2 cm 以上)20 例。每例均有完整的臨床資料，男49例、女36 例。食管癌組平均年齡(60 ±1)歲(40～77)歲，參照國際食管癌原發(fā)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):早期患者11 例，進(jìn)展期患者25 例，晚期患者9 例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者16例，有1 處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者15 例，有2 處腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者10 例，有3 處腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者4 例。所有病例均術(shù)前快速冷凍病理和術(shù)后常規(guī)病理檢查確診，標(biāo)本獲取后常規(guī)固定在10%福爾馬林液體中，然后用石蠟包埋。術(shù)前均未化療、放療及免疫治療。兩組患者年齡、性別、患病程度等無顯著性差異(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 鼠抗人HPV 單克隆抗體、P53 試劑盒均由(上海研域生物科技有限公司);增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、免疫組化染色試劑盒北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;臺(tái)式離心機(jī)(LD4－2A 型 北京京立離心機(jī)有限公司);恒溫水浴鍋(北京東方精瑞科技公司);超凈工作臺(tái)(天津市泰斯特儀器有限公司);光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠);AS325 輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(英國SHANDON公司);病理組織漂烘處理儀(PHY－Ⅲ，常州);IMAGEPLUS 6.0 圖象分析系統(tǒng)(日本MOTIC 公司)。

1.2.2 方法 每例標(biāo)本同時(shí)取材2 塊，一塊中性福爾馬林固定，石蠟包埋用于免疫組化、病理確診、組織分型等;一塊備用。組織切片依次置于二甲苯浸泡，加新配制的3%H2O2于組織切片上，室溫孵育10 min 后微波爐中加熱，用PBS 洗2 min;加正常山羊血清工作液(藍(lán)色液體)封閉，室溫孵育15 min，傾去勿洗;將HPV、P53 試劑充分混勻，不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免產(chǎn)生加樣上的誤差。根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)量來定。HPV、P53 用標(biāo)本稀釋液1∶1 稀釋后加入50 μL 于反應(yīng)孔內(nèi)。加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50 μL 于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50 μL 的生物素標(biāo)記的抗體，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，振蕩30 s，用吸水紙拍干，重復(fù)3 次。每孔加入80 μL 的親和鏈酶素－HRP，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，振蕩30 s，用吸水紙拍干，重復(fù)3 次。每孔加入底物A、B 各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min，避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL 終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果，在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 值，在兩個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值減去空白孔的OD 值后取其平均值計(jì)算。應(yīng)用curve 專業(yè)軟件算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。HPV ＞100 U/L、P53 ＞80 ng/mL 即為異常。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間指標(biāo)的比較采用t 檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析及q 檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HPV、P53 在食管癌中表達(dá)為(290 ±20)U/L、(189±15)ng/mL，均較其它兩組為高，正常組織中幾乎無表達(dá)，見表1。

表1 HPV、P53 在食管癌、良性瘤和正常組織中的表達(dá)水平()

2.2 HPV16/18 的表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系為隨著TMN 分期的升高，HPV、P53的表達(dá)率明顯增加，見表2。

表2 HPV16/18 的表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系()

3 討 論

人乳頭瘤病毒 (HPV)于1933 年被人類首次發(fā)現(xiàn)，HPV 是一類主要于鱗狀上皮層寄生的小分子DNA 腫瘤病毒，無包膜，不含脂質(zhì)，HPV 是感染人體組織中分布最廣的腫瘤病毒之一［6］。HPV 感染人體的主要靶細(xì)胞是有增生能力的表皮或者粘膜上皮細(xì)胞，即基底層細(xì)胞［7］。在這層細(xì)胞之上常覆有幾層不能增生分裂的已分化成熟的細(xì)胞層，即只有物理保護(hù)屏障受損時(shí)，病毒才能進(jìn)入基底層細(xì)胞。學(xué)者們認(rèn)為基底層細(xì)胞整合素(Integrin)可能是HPV 的病毒受體介導(dǎo)HPV 進(jìn)入基底細(xì)胞，進(jìn)行病毒復(fù)制和調(diào)控細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的主要原因?；讓蛹?xì)胞整合素還可以改變控制細(xì)胞周期的途徑，尤其與抑癌蛋白P53 和Rb 的結(jié)合可使正常細(xì)胞喪失細(xì)胞周期調(diào)控能力，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化［8］。P53 是一種抑癌基因(tumor suppressor gene)，在所有惡性腫瘤中，都會(huì)出現(xiàn)該基因的突變，這種基因控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)，許多有關(guān)細(xì)胞健康的信號(hào)向P53 蛋白發(fā)送［9］。細(xì)胞中抑制癌變的基因“P53”會(huì)判斷DNA 變異的程度，如果變異較小，這種基因就促使細(xì)胞自我修復(fù)，若DNA 變異較大，P53 就誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。P53 是重要的腫瘤抑制基因，說明該基因的改變很可能是人類腫瘤產(chǎn)生的主要發(fā)病因素［10］。本研究顯示三組患者乳腺組織中HPV、P53 表達(dá)水平比較(t=5.33、5.44、5.78，P ＜0.05，具有顯著性差異)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌者(t=5.66，5.65、5.77，P ＜0.05，具有顯著性差異);隨著TMN 分期的升高，HPV、P53 的表達(dá)率明顯增加(t=5.46、5.67，P ＜0.05，具有顯著性差異)。以此推論，一旦發(fā)生HPV 感染，P53 基因發(fā)生突變，使P53 蛋白失活，細(xì)胞分裂失去節(jié)制，就可發(fā)生癌變，另外HPV 與P53 基因組整合的作用也可能是引起HPV 致癌的另一個(gè)重要途徑，隨著病理分期增高表達(dá)而增高，HPV 在人體內(nèi)有很長(zhǎng)的潛伏期，一般感染二、三十年后才致癌，可能與病毒整合到宿主基因適當(dāng)?shù)奈恢煤臅r(shí)較長(zhǎng)有關(guān)［11］。

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