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    腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌易感性的相關(guān)性研究

    2013-06-11 09:06:16郭宇玲
    實(shí)用臨床醫(yī)學(xué) 2013年10期
    關(guān)鍵詞:期組多態(tài)性基因型

    郭宇玲,陳 麗,劉 佳,孫 哲

    (南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,南昌 330006)

    原發(fā)性肺癌(簡(jiǎn)稱肺癌)是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一。 肺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程,除環(huán)境因素外,個(gè)體的遺傳易感性因素也是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的重要原因。流行病學(xué)研究[1-2]表明,肺癌具有家族聚集現(xiàn)象,目前家族的遺傳易感性所起的作用逐漸為人們所重視。 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)位于6 號(hào)染色體短臂Ⅲ類MHC 區(qū)域,其啟動(dòng)子區(qū)域存在多種等位基因多態(tài)現(xiàn)象,TNF-α 基因多態(tài)現(xiàn)象與血清TNF-α 表達(dá)水平密切相關(guān),并與某些腫瘤的易感性有關(guān)。 有資料顯示,TNF-α 基因多態(tài)性可能與肺癌的易感性有關(guān),非小細(xì)胞肺癌約占肺癌點(diǎn)數(shù)的80%[3-4]。本研究旨在探討腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌易感性的關(guān)系。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 研究對(duì)象

    選擇2007 年1 月至2012 年1 月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科收治的非小細(xì)胞肺癌患者60 例(肺癌組),均符合病理學(xué)診斷。 其中男38例,女22例,年齡38~82 歲,平均51 歲;鱗癌38 例,腺癌22例。 臨床分期:Ⅰ+Ⅱ期14 例,Ⅲ+Ⅳ期46 例。 均簽署知情同意書。 另選擇同期門診體檢的健康人62例(對(duì)照組),男45 例,女17 例,年齡35~70 歲,平均47 歲。2組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2 主要試劑

    基因組DNA 提取試劑盒(北京天為時(shí)代公司)、2×Taq PCR MasterMix(北京天為時(shí)代公司)、DNA marker(Takara,Japan)、人TNF-α 引物(上海生工公司)、NcoⅠ(Fermentas)、MspⅠ(Fermentas)等。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)本采集

    采集肺癌組患者及對(duì)照組體檢健康者空腹、外周靜脈血2 mL。

    1.3.2 基因多態(tài)性分析

    采用PCR-RFLP 分析基因型,按照試劑盒操作方法提取全基因組DNA。 PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μL,內(nèi)含模板DNA 2 μL ,引物各1 μL,4×dNTP 4 μL,10×butter (不含Mgcl2)5 μL,Mgcl23 μL, Taq酶(3 U·μL-1) 1 μL, 雙蒸水25 μL。 將反應(yīng)液置于PCR 擴(kuò)增儀中,反應(yīng)條件: 預(yù)變性95 ℃5 min,變性95 ℃45 s,退火59 ℃45 s,延伸72 ℃45 s 共40個(gè)循環(huán),最后在72 ℃下延伸10 min。 擴(kuò)增完畢后,取10 mL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用10 U 限制性內(nèi)切酶StyI消化,反應(yīng)體系為總體積20 μL,擴(kuò)增后DNA 10 μL,10×buffer 2.5 μL,BSA 0.3 μL,StyI 酶0.5 μL,雙蒸水6 μL,并在37 ℃水浴中4 h 以上。 用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物,電泳分離完畢,置于300 nm 紫外燈下檢測(cè),觀察電泳條帶,以特定的DNA marker 為參照,確定基因型(封四圖1-2)。TNF-α-308 G/G:-87 bp 條帶;TNF-α-308 A/A:-107 bp 條帶;TNF-α-308 G/A:87 bp、107 bp 2條帶;TNF-α-238 G/G:-152 bp 條帶;TNF-α-238 A/A:-132 bp 條帶;TNF-α-238 G/A:-152 bp、-132 bp 2 條帶。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法,各組基因型和等位基因頻率差異比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法檢驗(yàn)來(lái)判斷TNF-α 基因-308 G>/A、-238 G>/A 多態(tài)現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性。

    2 結(jié)果

    2.1 TNF-α 基因啟動(dòng)子-308 位點(diǎn)多態(tài)性現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系

    肺癌組與對(duì)照組均未檢測(cè)出TNF-α-308 A/A純合子基因型,G/G 基因型頻率在2組的分布中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 鱗癌組與腺癌組、Ⅰ+Ⅱ期組與對(duì)照組的G/G 基因型與G/A 基因型在分布頻率上比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。 Ⅲ+Ⅳ期組與對(duì)照組的基因型分布頻率上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 但G/G 基因型與G/A 基因型在不同分期肺癌組中的分布的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)表1。

    表1 TNF-α-308 位點(diǎn)多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌及病理類型、臨床分期的關(guān)系

    2.2 TNF-α 基因啟動(dòng)子-238 位點(diǎn)多態(tài)性現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系

    肺癌組與對(duì)照組均未檢測(cè)出TNF-α-238 A/A純合子基因型,G/G 基因型頻率在2組的分布上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。鱗癌組、腺癌組與對(duì)照組相比,G/G 基因型與G/A 基因型頻率分布的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但G/G 基因型與G/A基因型在鱗癌組與腺癌組的分布頻率、腺癌組與對(duì)照組中的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。Ⅰ+Ⅱ期組與對(duì)照組的基因型分布頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ⅲ+Ⅳ期組與對(duì)照組的基因型分布頻率上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但G/G 基因型與G/A 基因型在不同分期肺癌組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)表2。

    表2 TNF-α-238 位點(diǎn)多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌及其病理類型、臨床分期的關(guān)系

    3 討論

    TNF-α 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用,TNF-α 的表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),TNF-α基因啟動(dòng)子的多態(tài)現(xiàn)象和TNF-α 的產(chǎn)物水平相關(guān)[5]。 TNF-α 基因在啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)-308 位點(diǎn)存在著2個(gè)基因多態(tài):TNF-α1 基因型和TNF-α2 基因型。 分析-308 位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響,發(fā)現(xiàn)TNF-α2基因型的患者體內(nèi)TNF-α 水平明顯高于TNF-α1基因型[6-7]。 同樣,TNF-α 基因在啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)-238A位點(diǎn)也存在著基因多態(tài)現(xiàn)象,存在G→A 變化。有研究認(rèn)為,銀屑病患者中-238 A 與TNF-α 的低表達(dá)密切相關(guān);TNF-α 啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)-308、-238 位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象與肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的易感性有關(guān)[8-10]。

    本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:肺癌組及對(duì)照組均未檢測(cè)出TNF-α-308 A/A、TNF-α-238 A/A 純合子,可能與其基因型在人群中分布頻率低及樣本量較小有關(guān)。 肺癌組基因型分布頻率高于對(duì)照組,因此推測(cè)TNF-α-308 位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌存在一定的關(guān)聯(lián)。 在Ⅰ+Ⅱ期組與對(duì)照組的比較中,TNF-α-308 G/A 基因型分布頻率無(wú)明顯差異,而Ⅲ+Ⅳ期組其分布頻率明顯高于對(duì)照組,提示TNF-α-308 A 等位基因?qū)Ψ伟┑陌l(fā)生發(fā)展可能有促進(jìn)作用。肺癌組TNF-α-238 G/A 基因型低于對(duì)照組,說(shuō)明其等位基因多態(tài)現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生也存在關(guān)聯(lián)。 Ⅰ+Ⅱ期組與對(duì)照組比較,基因型頻率分布無(wú)明顯差異,Ⅲ+Ⅳ期組與對(duì)照組比較,基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示TNF-α-238 等位基因可能與疾病進(jìn)展有關(guān),但也可能與樣本含量較小不能進(jìn)行多元回歸分析或基因分布頻率低有關(guān)。 且所研究的對(duì)象均為江西人,因此不能排除人種區(qū)別。 本研究沒(méi)有分析基因多態(tài)性對(duì)各種治療的影響,有待于今后密切隨訪患者,擴(kuò)大樣本含量進(jìn)行研究。

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