肝細胞癌組織中高爾基體糖蛋白73和分泌型聚集素的表達及其相關性分析

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，新疆 烏魯木齊 830054

肝細胞癌組織中高爾基體糖蛋白73和分泌型聚集素的表達及其相關性分析

曹茜 古麗比也·沙比爾 楊穎 肖蕾 毛睿 張瑞麗 張華 包永星

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，新疆 烏魯木齊 830054

背景與目的：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種具有高度侵襲、轉移性的常見惡性腫瘤，預后極差。因此，研究肝癌侵襲的機制，尋找有效的干預靶點顯得尤為重要。一些研究提示分泌型聚集素(secreted Clusterin，sCLU)和高爾基體糖蛋白73(Golgi glycoprotein 73，GP73)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉移過程中起重要作用，且兩者具有結構和功能上的相似性。本研究旨在探討GP73和sCLU在HCC中的表達及其與臨床病理特征和預后之間的關系。方法：收集新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院75例HCC患者癌組織及癌旁正常肝組織標本，采用免疫組化(EnVision二步法)檢測HCC組織中GP73、sCLU的表達水平；并與癌旁正常肝組織相比較；Spearman等級相關分析GP73和sCLU在肝癌中表達的關系；研究GP73和sCLU表達水平與HCC臨床病理特征及預后的關系。結果：GP73和sCLU在HCC中陽性表達率分別為72%和88%，癌旁正常肝組織的陽性表達率均為4%。GP73在HCC和正常肝組織中陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=73.60，P＜0.05)。sCLU在HCC和正常肝組織中陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=207.94，P＜0.05)；Spearman等級相關分析提示，HCC組織中，GP73和sCLU蛋白表達呈正相關(r=0.405，P＜0.05)；GP73和sCLU在HCC中表達水平與腫瘤的Edmondson病理分級、TNM分期及血管侵犯相關(P＜0.05)，而與患者的性別、年齡、HBsAg、合并肝硬化、AFP值、門靜脈癌栓、腫瘤數目無相關性(P＞0.05)；GP73表達與患者生存期有關，而sCLU表達與患者生存期無關。結論：GP73和sCLU在肝癌中有較高的陽性率，且GP73和sCLU表達呈正相關，GP73和sCLU可能與HCC的侵襲性等生物行為密切相關，檢測其表達將有助于評價患者預后。

肝細胞癌；高爾基體糖蛋白73；分泌型聚集素；侵襲；預后

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，預后較差，在全球惡性腫瘤的致死原因中位居第3位［1］。導致肝癌預后極差的主要原因是肝癌具有高度侵襲、轉移能力［2］，因此研究肝癌侵襲的機制，尋找有效的干預靶點顯得尤為重要。高爾基體糖蛋白73(Golgi glycoprotein 73，GP73)是一種高爾基體分泌性糖蛋白，在多種上皮細胞中表達，參與上皮細胞的多項生理及病理活動［3］。相關研究提示GP73在HCC中表達明顯上調［4-5］，且與血管浸潤、腫瘤分期有關［6］，由此推測GP73可能參與HCC的增殖、侵襲、轉移的過程。最新研究證實GP73和同樣定位于高爾基體的分泌型聚集素(secreted Clusterin，sCLU)功能相似［7］。sCLU是一種硫化異二聚體糖蛋白，幾乎表達于所有的組織和體液中［8］。研究發(fā)現sCLU在腫瘤的增殖、侵襲、轉移中起著重要作用［9］。本研究通過檢測GP73和sCLU在HCC中的表達水平，探討其與患者臨床病理特征和預后的關系，以及GP73和sCLU與HCC生物學行為的潛在相關性。

1 資料和方法

1.1 研究資料

選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行手術切除、臨床資料完整且剔除失訪的肝癌患者組織標本及其癌旁正常肝組織標本75例。所有標本均由新疆醫(yī)科大學第一附屬院病理科提供。所有患者術前均未行放療、化療或介入治療且術后病理學確診為HCC。根據美國癌癥協(xié)會(UICC)2011年TNM分期標準，75例HCC標本中Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期54例。根據Edmondson分級法，HCC標本中，Ⅰ～Ⅱ級15例，Ⅲ～Ⅳ級60例。經新疆醫(yī)科大學倫理委員會批準并征得患者的知情同意后，從本院病案室調閱病歷資料，包括性別、年齡、肝硬化程度、腫瘤大小、數目、TNM分期、血清AFP水平、腫瘤病理分級、有無血管侵犯、有無門靜脈癌栓等。對患者進行隨訪，并繪制生存曲線。

1.2 主要試劑及器材

兔抗人GP73多克隆抗體購自美國Proteintech Group公司。兔抗人sCLU多克隆抗體購自武漢博士德公司。免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。其他試劑包括PBS緩沖液、抗原修復液、枸櫞酸抗原修復液等。其他儀器包括LEICA DM3000顯微鏡、微波爐、恒溫培養(yǎng)箱SLI-700、冰箱、切片機、攤片機等。

1.3 染色方法

采用EnVision二步法進行免疫組織化學染色。HCC標本以4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。蠟塊以5 μm厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟，水化，先后經3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，微波爐枸櫞酸液修復。每批實驗設陽性和陰性對照。陽性對照是用含有靶抗原的切片進行對照。本實驗采取的陽性靶抗原為GP73蛋白和sCLU蛋白。實驗過程中加入兔抗人GP73多克隆抗體(一抗)和兔抗人sCLU多克隆抗體(一抗)進行免疫組化反應。其中GP73一抗工作液濃度為1∶50，sCLU一抗工作液濃度為1∶200。陰性對照是以PBS液取代一抗作陰性對照。加入一抗后將反應體系置于4 ℃冰箱過夜。次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(免疫組化試劑盒中提供的二抗)，后采用DAB顯色10～15 s，顯微鏡下觀察染色程度，用自來水終止顯色。最后蘇木素復染，中性樹脂膠封片。

1.4 結果判定

以細胞質顯色為棕黃色顆粒為陽性細胞。選取切片染色對比度較好，背景清晰，定位準確及排除出血、壞死部位和切片邊緣，在LEICA DM3000顯微鏡下觀察整張切片染色情況，統(tǒng)一光源、光圈亮度、對比度、色彩飽和度，關閉白平衡，拍攝照片，將照片儲存于計算機中，由2位病理科醫(yī)生根據染色強度進行雙盲結果判定，按著色強度給與組織評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。在高倍視野下(400×)隨機選取5個視野(每個視野觀察不少于100個細胞)，用Image-Pro Puls圖像分析軟件測定每張照片的陽性細胞百分比。按陽性細胞百分比給組織評分：無陽性細胞計為0分，1%～20%為1分，21%～50%為2分，51% ～80%為3分，＞80%為4分。兩項得分相乘，0～1分為“–”，2～4分為“+”；5～7分為“++”；8分以上為“+++”。本研究將“–、+”定義為蛋白低表達組即陰性組，“++、+++”定義為蛋白高表達組即陽性組。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。各指標在兩組之間陽性表達率的比較采用四格表Z檢驗，當理論值較小時，采用校正四格表χ2檢驗。各指標蛋白表達量在兩組間的比較服從正態(tài)性檢驗采用t檢驗，不服從正態(tài)性檢驗采用秩和檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，對數秩和檢驗log-rank test比較生存曲線的差別。指標間相關性采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GP73和sCLU在HCC和癌旁肝組織中的表達

免疫組化結果顯示，GP73和sCLU在肝細胞的細胞質中表達，顏色為棕黃色。HCC組織中GP73陽性表達率為72.00%(54/75)，sCLU 陽性表達率為88.00%(66/75)。癌旁正常肝組織中GP73和sCLU陽性表達率均為4.00%(3/75)。統(tǒng)計學分析表明：HCC組織中GP73陽性率高于癌旁肝組織(χ2=73.60，P＜0.05)，HCC組織中sCLU陽性率也高于癌旁肝組織(χ2=207.94，P＜0.05，圖1)。

圖 1 GP73和sCLU在HCC和癌旁肝組織中的表達Fig. 1 The expression of GP73 and sCLU in HCC and normal liver tissues

2.2 肝癌組織中GP73和sCLU表達的相關性

Spearman等級相關分析結果顯示，HCC標本中，GP73和sCLU表達呈正相關(r=0.405，P＜0.05)。

2.3 GP73和sCLU表達水平與HCC患者臨床病理特征的關系

研究發(fā)現HCC中GP73和sCLU表達水平與腫瘤的Edmondson病理分級、TNM分期及血管侵犯相關(P均＜0.05)，而與患者的性別、年齡、HBsAg、合并肝硬化、AFP值、門靜脈癌栓、腫瘤數目均無關(P＞0.05，表1)。

2.4 GP73和sCLU與患者預后的關系

隨訪75例HCC患者，GP73陽性組54例，中位生存時間為7個月；陰性組21例，中位生存時間為13個月，繪制Kaplan-Meier生存曲線并進行Log-rank檢驗，結果表明GP73陽性組與陰性組生存時間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=28.72，P＜0.05)。sCLU陽性組66例，中位生存時間為8個月；陰性組9例，中位生存時間為9個月。生存曲線及Log-rank檢驗表明：sCLU陽性組與陰性組生存時間比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.661，P＞0.05，表2，圖2)。

表 1 肝癌組織中GP73和sCLU表達與臨床病理資料關系Tab. 1 The correlation between GP73 and sCLU with clinicpathologic features

表 2 GP73和sCLU生存期的比較Tab. 2 Survival time of HCC patients by GP73 and sCLU

圖 2 肝癌患者生存曲線圖Fig. 2 The survival curves of HCC patients

3 討 論

2000年，美國學者Kladney等［10］在研究成人巨大細胞性肝炎病原學時，首次發(fā)現了GP73。健康人肝細胞很少表達GP73，而在肝臟出現急慢性炎性反應或肝纖維化時，表達明顯上調，發(fā)展到HCC時，GP73的表達達到高峰［11］。近年來在一項多中心、大樣本、多人種的國際性研究中提出GP73診斷肝癌的敏感度和特異度均高于AFP，可作為肝癌早期診斷的新型腫瘤分子標志物［4］。但目前對于GP73的研究多停留在作為血清腫瘤標志物的方向，而其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的調節(jié)機制及功能的報道均較少見。

研究提示GP73和sCLU存在結構和功能上的相似之處。二者均定位于高爾基體；GP73基因的C末端截短的小鼠患有局灶性節(jié)段性腎小球硬化，而敲除sCLU基因后出現進展性腎小球硬化［3］。本研究通過免疫組化方法在組織水平上發(fā)現HCC組織中GP73和sCLU蛋白陽性表達率均高于癌旁正常肝組織，Spearman等級相關分析顯示，HCC中GP73和sCLU表達呈正相關?；谝陨涎芯拷Y果，我們考慮GP73和sCLU在調控機制上存在相關性和重疊性。

目前研究認為sCLU是一種硫化異二聚體糖蛋白，在多種腫瘤的侵襲、轉移中起著重要的作用［12-13］。熊茂明等［14］也提出sCLU與肝癌分化程度有關。本研究證實，GP73和sCLU與腫瘤病理分級、血管侵犯以及腫瘤分期明顯相關?？紤]到GP73與sCLU的相互關系，推測GP73可能與sCLU一樣參與了肝癌的侵襲、轉移過程。

對75例HCC患者隨訪結果顯示，GP73陽性組與陰性組生存時間比較差異有統(tǒng)計學意義，這說明HCC組織中GP73表達高的患者生存期短，由此可見，檢測GP73可能有助于判斷HCC的預后。

綜上所述，GP73是極具研究價值的分子靶點。檢測GP73在HCC中的表達，可以作為判斷肝癌的惡性程度、侵襲性及預后的重要參考指標，這將有助于指導臨床治療及評估病情。鑒于目前對于sCLU和GP73的分子生物學特性仍知之甚少，如阻斷其表達是否可達到治療HCC的目的等，還有待進一步深入研究。

［1］ KEW M C. Epidemiology of chronic hepatitis B virus infection, hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus-induced hepatocellular carcinoma ［J］. Pathol Biol, 2010, 58(4): 273-277.

［2］ JEMAL A, BRAY F, CENTER M, et al. Global cancer statistics ［J］. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

［3］ KIM H J, LV D, ZHANG Y, et al. Golgi phosphoprotein2 in physiology and in diseases ［J］. Cell Biosci, 2012, 2(1): 31.

［4］ MAO Y, YANG H, XU H, et a1.Golgi protein 73 (GOLPH2) is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma ［J］. Gut, 2010, 59(12): 1687-1693.

［5］ 楊穎, 木尼熱·馬合蘇提, 包永江, 等. GP73和AFP單項與聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌的價值 ［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志, 2012, 35(11): 1034-1037.

［6］ 楊穎, 肖蕾, 毛睿, 等. 高爾基體糖蛋白73的表達特征及其對肝癌與肝硬化的鑒別診斷價值 ［J］. 中華肝臟病雜志, 2012, 20(12): 920-924.

［7］ ZHOU Y, LI L, HU L, et a1. Golgi phosphoprotein 2 (GOLPH2 /GP73/GOLM1) interacts with secretory clusterin ［J］. Mol Biol Rep, 2011, 38(3): 1457-1462.

［8］ PAJAK B, ORZECHOWSKI A. Clusterin: the missing link in the calcium-dependent resistance of cancer cells to apopogenic stimuli ［J］. Postepy Hig Med Dsew, 2006, 60: 45.

［9］ TROUGAKOS I P, DJEU J Y, GONOS E S, et al. Advances and challenges in basic and translational research on clusterin［J］. Cancer Res, 2009, 69(2): 403-406.

［10］ KLADNEY R D, BULLA G A, GUO L, et a1. GP73，a novel Golgi-localized protein upregulated by viral infection ［J］. Gene, 2000, 249(1-2): 53-65.

［11］ LIU X, WAN X, LI Z, et a1. Golgi protein 73(GP73), a useful serum marker in liver diseases ［J］. Clin Chem Lab Med, 2011, 49(8): 1311-1316.

［12］ SUN B, ZHANG S D, et al. Clusterin is associated with spontaneous breast cancer in TA2 mice ［J］. FEBS Lett, 2007, 581(17): 3277.

［13］ JULY L V, BERALDI E, SO A, et a1．Nucleotide-based therapies targeting Clusterin chemosensitized human lung adenocarcinoma cells both in vitro and in vivo ［J］. Mol Cancer Ther, 2004, 3: 223.

［14］ 熊茂明, 錢福永, 李賀, 等. 原發(fā)性肝癌中Clusterin異常表達與多藥耐藥關系的研究 ［J］. 肝膽外科雜志, 2007, 1: 34-38.

Expression of Golgi glycoprotein 73 and secreted Clusterin in hepatocellular carcinoma

CAO Qian, SHABIER Gulibiye, YANG Ying, XIAO Lei, MAO Rui, ZHANG Rui-li, ZHANG Hua, BAO Yong-xing (Tumor Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi Xinjiang 830054, China)

BAO Yong-xing E-mail: baoyx@vip.sina.com

Background and purpose: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common cancer with poor prognosis. The main reason leading to the poor prognosis of HCC is the highly invasive and metastatic ability. Therefore, trying to know the mechanism of HCC invasion and getting an effective interventions target is very important. Some studies suggest that secreted clusterin (sCLU) and Golgi glycoprotein 73 (GP73) played important roles in the development of tumour process, and both of them have structural and functional similarities. The aim of the article was to investigate the expression of GP73 and sCLU in HCC and their relationship with the clinicopathological features and the prognosis, and finally to evaluate the value of them. Methods: Seventy-five cases of HCC were collected. Immunohistochemistry (IHC) was used to determine the expression of GP73 and sCLU in HCC and normal liver tissues. Spearman rank was used to analyze the correlation between GP73 and sCLU in HCC. The relationship of GP73 and sCLU expression with the clinicopathological features and the prognosis was investigated. Results: The positive rates of GP73 and sCLU in HCC were 72% (54/75) and 88% (66/75) respectively; but in normal liver tissues,it was 4% (3/75). GP73-positive rate in HCC was higher than that of the normal liver tissues (χ2=73.60, P＜0.05). sCLU-positive rate in HCC was also higher than that of the normal liver tissues (χ2=207.94, P＜0.05). GP73 expression was positively correlated with sCLU expression in HCC (r=0.405, P＜0.05). GP73 and sCLU were associated with clinicopathological features including tumor differentiation, TNM stage and vascular invasion (P＜0.05); GP73 and sCLU had no correlation with the patient’s gender, age, HBsAg, cirrhosis, AFP value, portal vein thrombosis and tumor numbers (P＞0.05). GP73 was associated with survival but not sCLU. Conclusion: GP73 and sCLU have higher positive rates in HCC and GP73 is positively correlated with sCLU. The expression of GP73 and sCLU are probably closely related with the invasion of HCC, which can help evaluate the prognosis of the patients.

Hepatocellular carcinoma; Golgi glycoprotein 73; Secreted Clusterin; Invasion; Prognosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.005

R735.7

：A

：1007-3639(2013)11-0880-05

2013-08-05

2013-10-12）

烏魯木齊市科學技術計劃感染與腫瘤重點實驗室(No：H111313001)；吳階平基金會臨床研究課題(No：320.6799.1138)；新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科研專項基金(No：2012，YFY07)。

包永星 E-mail:baoyx@vip.sina.com