禽源空腸彎曲桿菌的分離與雙重PCR鑒定

翟海華 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271000）

王 娟 常維山 王君瑋 （中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 青島）

試驗(yàn)研究

禽源空腸彎曲桿菌的分離與雙重PCR鑒定

翟海華 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271000）

王 娟 常維山 王君瑋 （中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 青島）

以空腸彎曲桿菌保守基因mapA和hipO基因?yàn)榘谢?，建立空腸彎曲菌的雙重PCR方法，該方法只對空腸彎曲菌有特異性，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等則不能擴(kuò)增出特異性片段。利用該方法對從市場、養(yǎng)殖雞和屠宰場的禽源空腸彎曲菌進(jìn)行了分離和鑒定，平均分離率為35.8%,PCR鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果相一致，說明建立的雙重PCR鑒定方法具有靈敏、特異的特點(diǎn)，可節(jié)省傳統(tǒng)生化鑒定所耗費(fèi)的時(shí)間，為空腸彎曲菌的檢測提供新方法。

空腸彎曲菌 分離 雙重PCR

食源性致病菌作為一個(gè)公共衛(wèi)生問題是影響食品衛(wèi)生安全的主要因素之一，而空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)就是食品衛(wèi)生中一種非常重要的食源性致病菌。它是引起人類細(xì)菌性腹瀉的最重要原因之一，在很多動(dòng)物特別是禽類體內(nèi)屬于正常攜帶細(xì)菌，如果屠宰過程中不注意衛(wèi)生操作，或者加工不完全，便能夠通過食物鏈傳遞給人類?？梢砸鹑祟惏l(fā)熱、急性胃腸炎，兒童易發(fā)病，免疫低下者會進(jìn)一步導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦炎、敗血癥等全身性疾病，最嚴(yán)重的并發(fā)癥是某些血清型的C.jejuni感染會引起周圍神經(jīng)自身免疫性疾病-格林巴利綜合癥(Guillain Barre syndrome, GBS)?？漳c彎曲桿菌屬于彎曲桿菌屬，是革蘭氏染色陰性菌；具有多形性，呈弧形、螺旋形、海鷗展翅形或S形；無芽胞；一段或兩端有一根鞭毛，呈螺旋性滾動(dòng)，陳舊培養(yǎng)基中菌形變球狀，喪失動(dòng)力；為微需氧菌，在大氣或厭氧的環(huán)境中菌不生長。是人畜共患的致病菌，在畜牧業(yè)上，空腸彎曲桿菌可以引起牛和綿羊流產(chǎn)，火雞的肝炎和藍(lán)冠病，童子雞和雛雞壞死性肝炎，雛雞、犢牛、仔豬的腹瀉等多種疾病。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種病原微生物的檢測，本研究利用空腸彎曲桿菌的特異性的外膜蛋白A基因(mapA)和馬尿酸基因(hipO)對從市場和屠宰場分離到的空腸彎曲菌進(jìn)行雙重PCR鑒定，不僅方便快捷，節(jié)省了生化試驗(yàn)的時(shí)間和成本，而且特異性強(qiáng)，可信度高。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基 Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基(北京路橋)，空腸彎曲桿菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)以及配套試劑(sigma公司)，哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)(OXOID公司)。

1.2 主要試劑及器材 新鮮綿羊血(青島海博生物科技公司)，2×Taq PCR Master Mix(Promega公司)，DNA marker DL2000(TaKaRa寶生物(大連)有限公司)，厭氧培養(yǎng)盒和微需氧產(chǎn)氣袋(日本三菱公司)。

1.3 樣品來源 青島市市場上出售活雞的泄殖腔棉拭子，中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心門診實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖雞的泄殖腔棉拭子，青島市某禽屠宰場雞盲腸。

1.4 試驗(yàn)菌株 空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33560，大腸埃希菌ATCC 25922，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213，阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 51329，鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）50115由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基制備 Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基：稱取12.7g培養(yǎng)基溶于l000ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻至適當(dāng)溫度，無菌分裝至5ml離心管中，4℃保存?？漳c彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基：40g培養(yǎng)基溶于lO00ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻到50℃左右時(shí)加入5%新鮮綿羊血和空腸彎曲菌瓊脂補(bǔ)劑III(Skirrow)，空腸彎曲菌瓊脂補(bǔ)劑III(Skirrow)事先用2ml蒸餾水溶解，無菌倒平皿，4℃保存?zhèn)溆谩８鐐惐葋喲桨澹?9g培養(yǎng)基溶于lO00ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻到50℃左右時(shí)加入5%新鮮綿羊血，無菌倒平皿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集的泄殖腔棉拭子置于滅菌Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基中，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基上。采集的盲腸樣包裝好，同樣低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用接種環(huán)勾取少量盲腸內(nèi)容物，劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基上。劃好的培養(yǎng)基放入?yún)捬跖囵B(yǎng)盒內(nèi)，加上微需氧產(chǎn)氣袋，42℃培養(yǎng)36～48h。選擇可疑菌進(jìn)行染色鏡檢，并接種于哥倫比亞血平板進(jìn)行純化，純化培養(yǎng)2～3代后可以進(jìn)行甘油保存或血清保存。

2.3 PCR鑒定 （1）引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank上發(fā)表的空腸彎曲桿菌特異性基因mapA，hipO的序列設(shè)計(jì)了兩對引物，分別是mapA上游：CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG，mapA下游：GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A，擴(kuò)增片段長度為589bp；hipO上游：ACT GCA AAA TTA GTG GCG，hipO下游GAG CTT TAG CAA ACC TTC C，擴(kuò)增片段長度為1028bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。（2）模版DNA提取：用接種環(huán)挑取哥倫比亞培養(yǎng)基上的適量菌落于500μL滅菌的超純水中，渦旋混勻，12000rpm/min，離心5min，移去上清；再加入200μL滅菌水，吹打混勻，放入100℃水浴鍋內(nèi)作用10min；取出立即冰浴5～10min，12000rpm/min，離心5～10min，取上清于新的1.5ml離心管中。（3）PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系(25μL):2×Taq PCR Master Mix12.5μL，DNA模板1.5μL，引物各0.5μL，雙蒸水9μL。循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖(0.5×TBE)凝膠電泳后，觀察并成像。（4）特異性試驗(yàn)：提取空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33560與大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株6種細(xì)菌DNA，進(jìn)行雙重PCR方法的特異性考察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在空腸彎曲桿菌選擇性培養(yǎng)基上可疑菌落呈灰色或棕黃色或淺紅色、圓形，半透明，扁平濕潤有光澤，有呈沿接種線向外擴(kuò)散的趨勢。染色鏡檢為螺旋形、彎曲桿狀或似飛翔的海鷗形的革蘭氏陰性細(xì)菌。

2.2 雙重PCR方法的特異性 電泳結(jié)果表明，該兩對引物僅能對空腸彎曲桿菌擴(kuò)增出兩個(gè)特異片段，大小分別約為1028bp和589bp，與設(shè)計(jì)DNA片段大小相符。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌均未有擴(kuò)增產(chǎn)物(附圖)。表明該方法具有很好的特異性。

2.3 雙重PCR方法的應(yīng)用 利用上述細(xì)菌分離方法和雙重PCR方法，對從市售活雞上采集的20份泄殖腔棉拭子，中心養(yǎng)殖雞的30份泄殖腔棉拭子，青島某屠宰場100份盲腸樣進(jìn)行空腸彎曲桿菌的分離鑒定，其中市售活雞樣品分離到8株空腸彎曲桿菌，分離率為40%，養(yǎng)殖雞樣分離得到13份菌株，分離率為43.3%，屠宰場盲腸樣分離到24株，分離率為24%。

附圖 雙重PCR引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

（1）空腸彎曲桿菌常用的選擇性分離培養(yǎng)基主要有兩大類：一類是含血液的培養(yǎng)基，像Campy-BAP瓊脂、Skirrow瓊脂和Butzler氏瓊脂等；另一類是不含血液的培養(yǎng)基如CCDA、卵黃瓊脂等。這些培養(yǎng)基中的血液、碳粉和鐵鹽可以吸附氧氣和毒性物質(zhì)，從而保證空腸彎曲菌具有良好的生長狀態(tài)。我們使用的空腸彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基屬于Skirrow瓊脂，典型菌落灰色或棕黃色或淺紅色、圓形，半透明，扁平濕潤有光澤，比較容易分辨。（2）空腸彎曲桿菌是微需氧菌，微需氧產(chǎn)氣袋可以吸收容器中1/2的O2，使CO2濃度變?yōu)?%～8%，從而制造出微需氧的環(huán)境。使用產(chǎn)氣袋，產(chǎn)生的氣體環(huán)境穩(wěn)定，方便快捷，但是成本較高。也可以在密閉容器內(nèi)充入混合氣體，具體比例為N285%，CO210%，O25%。使用混合氣體成本低，就是操作較復(fù)雜，可以在初次分離培養(yǎng)時(shí)用微需氧產(chǎn)氣袋，純化培養(yǎng)時(shí)用混合氣體。（3）空腸彎曲桿菌的準(zhǔn)確鑒定可以為它的流行病學(xué)及和危害評估提供重要依據(jù)，由于空腸彎曲桿菌培養(yǎng)條件比較苛刻，需要微需氧環(huán)境，而且它具有生化反應(yīng)的惰性，所以其傳統(tǒng)的生化鑒定較為困難。PCR這一分子生物學(xué)手段要比傳統(tǒng)方法快速靈敏，雙重PCR又比傳統(tǒng)PCR方法特異性更強(qiáng)，可靠性更高。

本試驗(yàn)根據(jù)空腸彎曲桿菌mapA和hip O 基因序列設(shè)計(jì)兩對引物，用于空腸彎曲桿菌的檢測，結(jié)果表明該二重PCR方法對空腸彎曲桿菌具有特異性，而對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等其他細(xì)菌均不能擴(kuò)增出特異性片段。這種方法的建立大大節(jié)省了生化試驗(yàn)所消耗的成本和時(shí)間，而且特異性、敏感性高，更加適用于臨床和流行病學(xué)調(diào)查。

[1]Chen J, Sun X, Zeng Z, et al. Campylobacter enteritis in adult patients with acute diarrhea from 2005 to 2009 in Beijing, China[J]. Chinese Medical Journal-Beijing, 2011, 124(10): 1508.

[2]Chaisowwong W, Kusumoto A, Hashimoto M, et al. Physiological characterization of Campylobacter jejuni under cold stresses conditions:its potential for public threat[J]. The Journal of Veterinary Medical Science 2012,74(1): 43-50.

[3]陳荀, 張曉利, 劉書亮. 動(dòng)物性食品源空腸彎曲桿菌二重 PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(2): 155-159.

[4]Eberle K N, Kiess A S. Phenotypic and genotypic methods for typing Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry[J]. Poultry Science, 2012, 91(1): 255-264.

[5]華文浩, 王慧珠, 趙輝等. HIV/AIDS 相關(guān)性慢性腹瀉患者感染空腸彎曲菌的臨床分析[J]. 中國全科醫(yī)學(xué), 2011, 14(20).

[6]趙勤英, 沈翠芬, 閔麗珊. TaqMan PCR 快速檢測食品中空腸彎曲菌[J]. 中國高等醫(yī)學(xué)教育, 2011, 6: 064.

S852.61+2

A

1007-1733(2013)11-0001-03

2013–07–24）