雞傳染性貧血病LAMP檢測方法的建立

吳煥榮 趙全興 楊欣欣 楊慧玲 國 琳（山東眾成飼料科技有限公司 山東省禽用飼料工程技術(shù)研究中心 山東 肥城 271600）

潘志剛 （山東省煙臺市萊山區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所）

雞傳染性貧血病LAMP檢測方法的建立

吳煥榮*趙全興 楊欣欣 楊慧玲 國 琳（山東眾成飼料科技有限公司 山東省禽用飼料工程技術(shù)研究中心 山東 肥城 271600）

潘志剛 （山東省煙臺市萊山區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所）

本文借助環(huán)介導等溫擴增技術(shù)，建立了雞傳染性貧血病的快速檢測方法。通過提取DNA模板，設(shè)計特異性LAMP引物，成功擴增出梯形條帶。結(jié)果表明，LAMP能檢測出最低DNA量約為0.245pg/μl，而PCR能檢測出最低DNA量約為2.45pg/μl；且具有特異性，對其他相關(guān)雞病病原檢測結(jié)果均為陰性。用建立的LAMP方法對臨床樣品進行檢測，同時與PCR方法比較，結(jié)果表明LAMP檢測的陽性率要比PCR高。LAMP檢測方法無需昂貴設(shè)備，適用于雞場的臨床快速診斷。

雞傳染性貧血病毒 環(huán)介導等溫擴增技術(shù) PCR 檢測

雞傳染性貧血病(Chicken Infectious Anemia，CIA)是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus, CIAV)引起雛雞的以再生障礙性貧血和全身性淋巴組織萎縮為特征的一種免疫抑制性疾病，經(jīng)常合并、繼發(fā)和加重病毒、細菌和真菌性感染，危害很大[1,2]。國內(nèi)外的病原分離和血清學調(diào)查結(jié)果表明，雞傳染性貧血病可能呈世界性分布，由雞傳染性貧血病毒誘發(fā)的疾病已成為一個嚴重的經(jīng)濟問題，特別是對肉雞的生產(chǎn)[3,4]。

目前針對該病的診斷方法有ELISA、DNA探針、常規(guī)PCR、實時PCR等，這些診斷方法對實驗條件要求比較高，而且對操作者要求具有很好的專業(yè)背景，環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本Notomi等在2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法[5]，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計四種特異引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴增核酸，具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡便等特點。LAMP方法是一種新型的DNA環(huán)介導等溫擴增反應，不需要特殊的儀器設(shè)備，只需要用普通的水浴鍋就可以完成整個診斷過程，而PCR反應程序比較復雜，反應時間較LAMP反應時間長，而且LAMP檢測的靈敏度遠高于PCR，本文研究利用LAMP技術(shù)診斷這種疾病。

1 試驗材料

1.1 材料 CIAV標準毒CuX-1株(M55918)由公司實驗室保存，ALV毒株由山東農(nóng)業(yè)大學贈予。pTCIAV陽性克隆、ALV陽性克隆均由公司實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器 Bst DNA聚合酶，大片段(New England Biolabs)；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒；Pst I 限制性內(nèi)切酶,SYBR Green染色液；Tris-HCl，EDTA；NaCl；SDS；Betaine(5mol/L)購自Sigma公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶購自Sigma公司；pGEM-T easy VectorKit購自Invitrogen公司；PCR反應試劑、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA片段回收試劑盒、感受態(tài)細胞E.coli.Top10菌株購自北京天根科技有限公司；PCR儀、水浴鍋等。

2 試驗方法

2.1 模板的制備 CIAV DNA的提?。喝IAV病料液100μl加入20μl的裂解液(10mmol/L，Tris-HCl；1mmol/L，EDTA；15mmol/L，NaCl；0.5%，SDS)，震蕩混勻后，煮沸10min，最后12000r/min4℃離心10min，取上清作為模板，進行LAMP。

2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的雞傳染性貧血病毒基因序列(Cux-1：M55918)中的保守區(qū)運用Primer Explorer Version 3設(shè)計兩套特異性的LAMP引物，包括兩條外引物F3、B3和兩條內(nèi)引物FIP、BIP，另外為了加速反應速度，縮短反應時間設(shè)計了LF、LB環(huán)引物，其中為了確定擴增產(chǎn)物的特異性，使用限制內(nèi)切酶Pst I進行酶切，識別F2和F1c之間的位點，產(chǎn)生的片段與推測的大小(184bp和221bp)相符。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2.3 LAMP擴增反應條件 CIAV LAMP反應體系25μl，包括：dNTPs 1.6mmol/l、FIP/BIP 1.6umol/l、F3/B3 1.6umol/l、LF/LB 0.4umol/l、Betaine(5mol/L)，5.0μl、MgCl2(25mmol/l)，2.5μl、Bst DNA聚合酶大片段2μl、10×ThermoPolbuffer 2.5μl、DNA模板2μl，加雙蒸水補足至25μl；混勻后63℃溫浴30min，85℃滅活5min；產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.4 CIAV LAMP產(chǎn)物酶切鑒定 LAMP產(chǎn)物按照天根公司普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒說明書進行純化。20μl的酶切體系包括：純化的DNA 5μl；10×buffer 2μl；Pst I 2μl；雙蒸水11μl。37℃恒溫12h，瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。

2.5 LAMP反應的特異性實驗 取5種病原包括雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增生病毒(REV)、雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽白血病病毒(ALV)的DNA或cDNA為模板進行LAMP擴增。

2.6 LAMP反應靈敏度的檢驗 取CIAV全基因組克隆陽性克隆pTCIAV，搖菌12-16h后，提取質(zhì)粒，測定OD260nm處的吸光值，換算為核酸含量，然后10倍系列稀釋，各稀釋度為模板分別進行PCR和LAMP擴增。

2.7 LAMP與PCR檢測方法的對比及臨床樣品檢測 設(shè)計合成用于CIAV的PCR檢測的一系列引物，按照已建立的CIAV的PCR檢測步驟對10倍稀釋的陽性標準品進行檢測，并與LAMP的結(jié)果進行對比。用上述兩種方法對所采集的40份臨床樣品進行檢測，對檢測結(jié)果進行比較。

3 試驗結(jié)果

3.1 LAMP檢測方法的建立 以本研究設(shè)計的兩套特異性引物分別對雞傳染性貧血病毒(Cux-1∶M55918)基因組DNA進行LAMP擴增。電泳檢測結(jié)果如圖1、2，結(jié)果顯示以CIAV DNA為模板的LAMP擴增產(chǎn)生階梯狀條帶，以及CIAV LAMP擴增產(chǎn)物的酶切結(jié)果。

圖1 雞傳染性貧血病病毒LAMP產(chǎn)物的電泳檢測

圖2 雞傳染性貧血病病毒LAMP擴增產(chǎn)物Pst I酶切鑒定

3.2 反應結(jié)束后，向產(chǎn)物中加入1μl SYBR GreenI染料，自然光下CIAV 陽性管呈綠色，而陰性管仍為染料原色橙色；紫外燈下CIAV陽性管呈現(xiàn)明顯的熒光，而陰性管則無特異性熒光(圖3)。

圖3 雞傳染性貧血病病毒LAMP產(chǎn)物染色反應

3.3 LAMP檢測CIAV的特異性試驗 用建立的LAMP方法分別以IBDV、REV、NDV、IBV和ALV的DNA或cDNA為模板進行LAMP特異性檢測，按照優(yōu)化后的LAMP體系進行63℃等溫擴增，取反應后的產(chǎn)物5μl用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果僅以CIAV的DNA為模板可擴增出LAMP特征性梯形條帶，而對照病原均為陰性(見圖4)，表明LAMP檢測方法對CIAV的檢測有良好的特異性。

3.4 LAMP檢測CIAV的敏感性試驗 將提取的DNA(濃度為0.245μg/ml)10倍稀釋至10-4，分別進行PCR和LAMP檢測(圖5、6)。結(jié)果表明，LAMP能檢測出最低DNA量約為0.245pg/μl，而PCR能檢測出最低DNA量約為2.45pg/μl。 3.5 LAMP臨床樣品檢測 利用PCR和LAMP分別對送檢的40份樣品進行檢測，結(jié)果顯示，PCR方法檢出8份陽性，LAMP方法檢出12份陽性，陽性檢出率分別為20%和30%，表明LAMP方法較PCR方法更為敏感。

圖4 LAMP方法檢測CIAV的特異性試驗

圖5 PCR方法檢測CIAV的敏感性試驗

圖6 LAMP方法檢測CIAV的敏感性試驗

4 討論

（1）當前，在我國集約化程度高的大型雞場中的雞群中普遍存在著不同免疫抑制性病毒感染，而且不同形式的免疫抑制性疾病已對我國養(yǎng)雞業(yè)特別是肉雞生產(chǎn)帶來很大威脅。家禽免疫抑制性病原體有很多種，除了馬立克氏病毒(MDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)外，J亞群白血病病毒(ALV-J)、網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增生病毒(REV)和呼腸孤病毒(Reovirus)感染機體皆可引起胸腺、法氏囊及其他淋巴細胞嚴重缺失[6,7]，降低機體的免疫功能。其中CIAV病毒既能通過種蛋垂直傳播，又可在雞群內(nèi)水平傳播，對養(yǎng)雞業(yè)的危害嚴重，為及時診斷該病，急需發(fā)展快速、靈敏、準確而且操作簡便的檢測技術(shù)來滿足基層和現(xiàn)場檢測的需要[8]。（2）LAMP方法在病原的診斷方面呈現(xiàn)出良好的應用前景，是一種新的核酸診斷技術(shù)。目前，已經(jīng)開展了應用LAMP技術(shù)對多種病原微生物的檢測[9,10]，包括西尼羅河熱病毒、日本腦炎病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒等。（3）本研究建立了一種針對CIAV的LAMP快速檢測方法。首先根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物，合適的引物對于LAMP反應的成功至關(guān)重要，特異性的區(qū)域保證了反應的特異性，引物的正確結(jié)構(gòu)保證了莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA的形成和延伸。使用CIAV的DNA為模板，測試引物的擴增效率和對反應體系進行優(yōu)化，Mg2+、dNTPs、Betaine和反應時間、溫度都對LAMP的結(jié)果有影響。該方法敏感性高，可檢測到0.2pg/μl；特異性強，對IBDV、REV、NDV、IBV和ALV等的檢測結(jié)果均為陰性。應用建立的LAMP方法，對送檢的臨床樣品進行檢測，陽性檢出率為30%，較普通PCR高，表明LAMP方法敏感性高。（4）本研究中LAMP方法與常規(guī)PCR檢測方法相比有顯著的優(yōu)點，首先LAMP成本低廉，利用BstDNA聚合酶在63℃實現(xiàn)等溫擴增，不需要昂貴的PCR儀；其次是反應迅速，可以在1h內(nèi)完成反應，而一般的PCR至少需要2～3h；然后是通過反應后向產(chǎn)物中加入熒光指示劑，肉眼在自然光或紫外光下可直接觀測結(jié)果，避免了電泳過程中的污染。（5）LAMP技術(shù)具有快速、簡便、靈敏、特異，無需貴重檢測設(shè)備而易普及等優(yōu)點。本方法適于在基層推廣、應用，在生產(chǎn)中發(fā)揮其應有的快速檢測作用。如果進行進一步的優(yōu)化和完善，該技術(shù)將會在CIAV的診斷及預防控制方面發(fā)揮巨大作用，從而為獸醫(yī)臨床診斷與治療提供參考。

[1] 殷震, 劉景華. 動物病毒學. 第2版. [M]. 北京∶ 科學出社, 1997.

[2] Y.M.Saif. 高福, 蘇敬良譯. 禽病學. 第11版. [M]. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005.

[3] 李啟明, 馬學軍, 周蕊等. 環(huán)介導逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因檢測中的應用[J]. 病毒學報, 2006, 22(5)∶ 334-338.

[4] 何金林, 徐云龍, 莫國華等. LAMP技術(shù)在疾病預防控制檢驗中的研究進展[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010,20(12)∶ 3561-3563.

[5] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleids Acids Research, 2000, 28(12)∶ 63.

[6] 蔣玲艷, 李平, 李莉萍等. 雞傳染性貧血病毒與其他禽免疫抑制性疫病病毒混合感染[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2006, 26(6)∶ 591-594.

[7] 陸洪菊, 趙敏, 翟劍平等. 雞傳染性貧血病在我國的流行、診斷及防制[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2005(5)∶ 54-55.

[8] 夏永恒, 楊兵, 張杰等. 2種雞免疫抑制性疾病LAMP檢測方法的建立[J]. 中國動物檢疫, 2009, 26(5)∶ 29-32.

[9] Hara Kudo Y, Yoshino M, Kojima T, etal. Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Salmonella[J]. FEMS Microbiol Lett, 2005,253(1)∶ 155-161.

[10] Soliman H, EI-Matbouli M. 2006. Reverse transcription loopmediated isothermal amplification(RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus(VHS)[J]. Veterinary Microbiology, 2006, 114∶ 205-213.

S858.31

A

1007-1733(2013)10-0018-03

2013–05–29）

山東省科技發(fā)展計劃(2011GNC11113)；泰安市科技發(fā)展計劃專項計劃(20113061)

*通訊作者