慢性乙型肝炎病毒感染者阿德福韋酯誘導耐藥突變與預存耐藥突變的比較分析

毛惠國 蔣素文 鄭南紅 胡愛榮 丁世雄 熊 陶

浙江省寧波市第二醫(yī)院 寧波 315010

慢性乙型肝炎病毒感染者阿德福韋酯誘導耐藥突變與預存耐藥突變的比較分析

毛惠國 蔣素文 鄭南紅 胡愛榮 丁世雄 熊 陶

浙江省寧波市第二醫(yī)院 寧波 315010

目的：對比分析慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者阿德福韋酯（ADV）誘導耐藥突變與預存耐藥突變的臨床及分子生物學特點。方法：ADV耐藥突變的慢性HBV感染者88例，采用基因測序的方法對患者的血清標本進行P區(qū)耐藥基因測序，同時檢測HBV基因型、HBV血清學標志物及HBV-DNA。結果：88例中，發(fā)現(xiàn)ADV預存耐藥突變9例（10.23%），其中部分患者（4/9，44.44%）曾接受過不規(guī)范的抗病毒治療；誘導耐藥組中以rtA181T突變及單個位點突變?yōu)橹鳎?1/79，51.9%；61/ 79，77.22%）、完全突變株40例、突變株與野生株共存39例，而預存耐藥組以rtN238T突變、多位點突變以及突變株與野生株共存為主；誘導耐藥組的HBV-DNA為（5.15±1.23）log10拷貝/mL，預存耐藥組為（6.45±0.97）log10拷貝/mL（t=-3.05，P=0.003）；誘導耐藥組中終末期肝病患者占40.51%（32/ 79），而預存耐藥組均為終末期肝病患者（P=0.001）；兩組在性別、年齡、E抗原狀態(tài)及HBV基因型構成方面比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：在未經(jīng)ADV抗病毒治療的慢性HBV感染者中可能存在ADV預存耐藥突變；誘導耐藥的準種變異經(jīng)過篩選后變得較單一，而預存耐藥的準種變異較復雜；終末期肝病患者中可能存在各種抗病毒藥物的預存耐藥突變；發(fā)生ADV誘導突變后的HBV-DNA復制水平常較低；患者應該接受和執(zhí)行規(guī)范的抗病毒治療和優(yōu)化治療，以實現(xiàn)預防耐藥，避免挽救治療。

肝炎病毒 乙型 阿德福韋酯 預存耐藥突變 誘導耐藥突變 基因測序

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者如果病情反復活動或者持續(xù)進展，則需要及時給予抗病毒治療[1]，但HBV耐藥突變的產(chǎn)生無法完全避免。因而加強抗HBV藥物的耐藥管理，做到由耐藥后的挽救治療前進為預防耐藥（優(yōu)選用藥及優(yōu)化治療），則顯得更加積極和主動。目前關于阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）耐藥率的研究報道較多，而關于其預存耐藥尤其是預存耐藥與誘導耐藥對比分析的研究較少。本研究旨在通過對比分析慢性HBV感染者ADV誘導耐藥與預存耐藥的臨床特點及分子流行病學特點，為指導規(guī)范抗病毒治療提供參考價值。報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2008年6月—2010年8月我院門診和住院發(fā)生ADV耐藥突變的慢性HBV感染者88例，其中ADV預存耐藥患者9例，ADV誘導耐藥患者79例，所有研究對象均經(jīng)過查閱病歷和電話隨訪證實。預存耐藥是指在應用抗病毒藥物治療之前患者體內(nèi)存在相關藥物的耐藥突變。預存耐藥患者檢測前均未接受ADV抗病毒治療，誘導耐藥患者均只接受ADV單藥治療。診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》的診斷標準[1]，終末期肝病包括肝炎肝硬化、重型肝炎（肝衰竭）和原發(fā)性肝癌。

1.2 方 法

1.2.1 標本的收集與處理 抽取清晨空腹靜脈血4管（3mL/管），分離出血清，一管置于-70℃冰箱待作P區(qū)耐藥基因測序及HBV基因型檢測；其余分別檢測血清HBV-DNA、HBV血清學標志物等。

1.2.2 檢測儀器及試劑 血清HBV-DNA檢測采用熒光定量PCR法（ABI 7500型熒光定量PCR儀），試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供（批準

文號：國藥準字S20040035）；HBV血清學標志物檢測采用美國雅培Abbott AxSYM System全自動化學發(fā)光酶免分析儀；ADV耐藥基因測序及基因型分析采用美國ABI3130型基因測序儀，核酸擴增熒光定量及測序試劑盒為上海申友生物技術有限責任公司生產(chǎn)（國食藥監(jiān)械準字2009第3400185號）。所有檢測均嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，HBV DNA水平進行對數(shù)轉換，數(shù)據(jù)以（±s）表示，連續(xù)性正態(tài)分布資料采用獨立樣本t檢驗，率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ADV預存耐藥 88例耐藥突變者中，發(fā)現(xiàn)ADV預存耐藥突變9例（10.23%），其中4例（44.44%）有除ADV外的不規(guī)范的核苷（酸）類似物（nucleos（t）ide analogue，NA）用藥史：2例患者曾接受拉米夫定（la?mivudine，LAM）治療，2例患者曾接受恩替卡韋（en?tecavir，ETV）治療，且均獲得病毒學應答及生化學應答，患者自行停藥后病情復發(fā)。4例患者均為C基因型HBV感染。在預存耐藥患者中未發(fā)現(xiàn)rtN236T位點變異，見表1。

2.2 ADV耐藥突變位點檢測結果 預存耐藥組的突變位點有rtL180M、rtM204V、rtA181T、rtV214A、及rtN238T突變/或共存突變，而誘導耐藥組的突變位點有rtL180M、rtM204V、rtV207M/L/I、rtS213T、rtA181T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T、rtT184L及rtM250L突變/或共存突變；其他耐藥位點如LAM、ETV相關耐藥位點的突變均伴存著ADV耐藥位點的突變。

誘導耐藥組以rtA181T突變?yōu)橹鳎?1/79，51.90%），其次為rtN236T（13/79，16.46%）和rtV214A（12/79，15.19%），rtP237H和rtN238T（均為2例，2.53%）較少；而預存耐藥組以rtN238T為主（4/9，44.44%），rtA181T突變只有1例；兩組突變位點rtA181T及rtN238T的構成比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.031，P=0.003）。

表1 ADV預存耐藥變異患者的基礎疾病、耐藥位點及用藥史分布

誘導耐藥組以單個位點突變?yōu)橹鳎?1/79，77.22%），而預存耐藥組以多個位點突變?yōu)橹鳎?/9，55.56%），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049）；誘導耐藥組以完全突變株為主（40/79，50.63%），而預存耐藥組以完全突變株和野生株共存為主（8/9，88.89%），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.033）。

2.3 ADV耐藥突變與患者年齡、HBV-DNA的關系 誘導耐藥組年齡20～68歲，平均（43.2±10.0）歲，預存耐藥組24～57歲，平均（45.9±10.5）歲，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.76，P=0.449）；誘導耐藥組HBV DNA水平3.16～7.78 log10拷貝/mL，預存耐藥組5.30～8.07 log10拷貝/mL，誘導耐藥組低于預存耐藥組（t=-3.05，P=0.003），見表2。

表2 ADV耐藥突變與患者年齡、HBV-DNA水平的關系

2.4 兩組患者性別構成、E抗原狀態(tài)、HBV基因型構成及終末期肝病構成的關系 誘導耐藥組中終末期肝病患者占40.51%（32/79），而預存耐藥組均為終末期肝病患者（9/9），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。誘導耐藥組男性患者66例、女性13例，預存耐藥組均為男性患者；誘導耐藥組HBeAg陽性36例，陰性43例，預存耐藥組HBeAg陽性4例，陰性5例；誘導耐藥組C基因型HBV感染者63例，B基因型HBV感染16例，預存耐藥組C基因型HBV感染8例，B基因型HBV感染1例；兩組在性別構成、E抗原狀態(tài)及HBV基因型構成等方面比較差異均無統(tǒng)計學意義（P= 0.345，1.000，1.000）。

3 討論

病毒的準種（quasispecies）是受遺傳變異、競爭及選擇作用影響的高度相關但不完全相同的變異株和重組基因組組成的動態(tài)種群[2]?！堵砸倚透窝追乐沃改稀穼BV感染者體內(nèi)形成的以一個優(yōu)勢株為主的相關突變株病毒群稱為HBV準種[1]。HBV高復制患者其準種復雜性較高，治療前就存在各種HBV毒株，包括可能與耐藥有關的突變株。因而HBV突變可在慢性感染過程中自然發(fā)生，即在抗病毒治療之前就有預存耐藥突變的可能[3-4]，稱之為預存耐藥。

關于ADV預存耐藥的情況鮮見報道。本研究在88例ADV耐藥突變的慢性HBV感染者中，檢測出可能與ADV相關耐藥位點的預存耐藥突變9例（10.23%），提示在未經(jīng)ADV抗病毒治療的慢性HBV感染者中可能存在預存耐藥突變。9例預存耐藥突變的患者中4例有不規(guī)范的NA用藥史（ADV除外），均為抗病毒治療顯效但患者自行停藥后病情復發(fā)，提示某種NA停藥病情復發(fā)后可能會誘導另一種NA的預存耐藥。因此，無論臨床醫(yī)生還是患者，均應該認識到加強抗病毒治療依從性的重要性，避免因不規(guī)范的抗病毒治療而導致難治性耐藥病毒株或者多重耐藥病毒株的出現(xiàn)。

目前公認的ADV主要耐藥相關突變位點是rtA181V/T/S和rtN236T；近年來研究報道其他多種ADV耐藥相關的突變位點，包括rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S、rtP237H和rtN238T/D，但對這些位點的突變與ADV耐藥的相關性仍存有爭議[5-6]。亦有報道rtI233V位點的變異導致HBV對ADV發(fā)生原發(fā)性耐藥，從而引起ADV治療失敗[7]。在本研究中，ADV的耐藥突變位點rtA181T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H和rtN238T均已發(fā)現(xiàn)。本組資料中突變株與野生株共存的患者較多，說明HBV準種的異質性和復雜性會明顯影響ADV的抗病毒效果：HBV病毒株的準種突變越復雜，ADV就越有可能誘導耐藥株產(chǎn)生，從而影響臨床療效[8]。

HBV的突變率是其他DNA病毒的10倍[9]，除了HBV的自然突變，還包括HBV為了適應各種生存壓力而產(chǎn)生多種突變：如宿主的免疫壓力或/和抗病毒藥物的壓力。ADV誘導耐藥組患者以單個位點突變?yōu)橹?，而預存耐藥患者以多個位點突變以及突變株與野生株共存為主，且預存耐藥組全部為終末期肝病患者。說明經(jīng)過ADV的抗病毒壓力篩選后，HBV的準種突變較為單一和集中；而預存耐藥患者由于不規(guī)范的抗病毒治療導致HBV準種突變較為復雜，單一位點的突變株不能成為優(yōu)勢株，常與野生株和其他位點的突變株共存；亦或者HBV感染時間越長（如終末期肝病患者），由于HBV在經(jīng)歷難以計數(shù)的傳代過程中與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，其發(fā)生各種耐藥突變的幾率越大。

ADV誘導耐藥位點與可能預存耐藥位點的分布較為不一致：誘導耐藥組患者以rtA181T突變?yōu)橹鳎c劉峰等[10]報道一致；雖然目前認為rtN236T突變較A181V突變的耐藥程度更高[6]，但筆者認為rtA181T位點的變異多發(fā)是否與中國患者以C基因型HBV感染有關，有待我國大樣本的進一步研究證實；而預存耐藥組以rtN238T突變?yōu)橹?，只?例存在明確的rtA181T突變，是否存在該位點為ADV預存耐藥突變主要位點的可能？尚需在可控性良好的體外實驗模型上進行藥效學實驗，以明確其表型耐藥情況。同時，在預存耐藥組患者中沒有發(fā)現(xiàn)典型的rtN236T突變，其原因可能是rtN236T的突變需要較長的篩選時間，特別是需要ADV的篩選[11]。

兩組患者的HBV基因型構成差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能與中國患者均以C基因型HBV感染為主有關[3]，且兩組在性別、年齡及E抗原狀態(tài)等方面比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由于本組資料預存耐藥患者的例數(shù)較少，可能存在統(tǒng)計學偏差，有待以后的研究中擴大樣本量深入研究。

總之，慢性HBV感染者在抗病毒治療之前就可能存在ADV或者其他NA的預存耐藥突變，且ADV誘導的耐藥突變位點復雜多樣，并常伴存其他NA的耐藥突變位點。盡管發(fā)生ADV耐藥突變后的HBV DNA水平有所下降，且這些位點的突變與ADV耐藥的相關性仍存有爭議，但上述情況的出現(xiàn)有可能導致顯著的生化學反跳及肝功能失代償。因此，在抗病毒治療之前盡可能進行預存耐藥突變的檢測（特別是終末期肝病患者），并根據(jù)患者的臨床特征進行合理的個體化用藥，以避免藥物選擇不當而造成后續(xù)的挽救治療，做到由耐藥后的挽救治療前進為預防耐藥，則顯得更加積極和主動；同時，應加強抗HBV藥物的耐藥管理，加強用藥的依從性，避免短期停藥。

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Com parative Analysis on Induced Resistance M utations and Pre-existing Resistance M utations Related to Ad e f o v i r Di p i v o x i l i n Pa t i e n t s w i t h Ch r o n i c He p a t i t i s BVi r u s I n f e c t i o n

MAOHuiguo，JIANGSuwen，ZHENGNanhong，etal.NingboNo.2Hospital,Ningbo(315010),China

Objective:To explore the molecular epidemiological and clinical characteristics of induced resistance mutations and pre-existing resistance mutations related to adefovir dipivoxil(ADV)in patients with chronic hepati?tis B virus(HBV)infection.M ethods:The data of 88 chronic HBV-infected patients with resistance mutations related to ADV from June 2008 to August 2010 were retrospectively analyzed.The gene resistance mutations of HBV P region were analyzed by gene sequencing,and the HBV genotypes,HBV serum markers,and HBV DNA levels were also analyzed.Results:There were 9 patients with pre-existing resistance mutations in 88 patients (10.23%)and 4 out of 9(44.44%)had ill-formed usage of antiviral drugs except ADV.Patients in induced muta?tion group mostly had rtA181T mutation and single mutated site(41/79,51.9%;61/79,77.22%);40 patients had com?plete mutation and 39 had mutation co-existence with wild strain.Patients with pre-existing mutations mostly had rtN238T mutation at multiple sites(5/9,55.56%)and co-existence mutations(8/9,88.89%).The levels of HBV DNA were 5.15±1.23 log10 copies/ml in the induced mutation group and 6.45±0.97 log10 copies/ml in the pre-existing mutation group(t=-3.05,P=0.003).There were 32 patients(32/79,40.51%)with end-stage liver dis?eases in the induced mutation group compared with all patients(9/9,100%)in the pre-existing mutation group(P=0.001).No statistically significant differences was noted in constituent ratio of age,sex,HBeAg and HBV genotypes between the 2 groups(P＞0.05).Conclusion:There may be some patients with pre-existing resistance mutations related to ADV in ADV treatment-naive patients.The HBV quasispecy mutations became unified after selection of ADV,whereas they were complex in the pre-existing mutation group.The pre-existing mutations related to nu?cleos(t)ide analogues maybe exist in patients with end-stage liver diseases.The levels of HBV DNA are always lower when patients have induced resistance mutation related to ADV.It is important for patients to accept and to execute normative usage of antiviral drugs and optimal treatment to reach the aim for preventing resistance and avoiding salvage therapy.

hepatitis B virus adefovir dipivoxil pre-existing resistance mutation induced resistance mutation gene sequencing

2012-09-17

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學研究基金（No：2008B167）；浙江省寧波市優(yōu)秀中青年衛(wèi)生技術人才資助項目（甬衛(wèi)發(fā)[2011]145號）；浙江省寧波市領軍和拔尖人才培養(yǎng)工程資助項目（甬人社發(fā)[2012]131號）

通迅作者：胡愛榮，E-mail:har1224@126.com