蒺藜皂苷對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的影響

陳志偉 梅慶步 張 琪 許惠玉 鄭立紅

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蒺藜為傳統(tǒng)中藥，蒺藜科(Zygophylaceae)蒺藜屬，植物蒺藜(Tribulus terrestris L.)的干燥成熟果實(shí)，性微溫，味辛苦，有小毒，主要成分是蒺藜皂苷。蒺藜皂苷具有抗衰老，促進(jìn)免疫功能增強(qiáng)和降血脂、血壓等功效〔1，2〕。近些年發(fā)現(xiàn)蒺藜皂苷類成分具有很好的抗腫瘤及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功效〔3〕。卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的疾病之一。目前臨床采用腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)與多種化療方案相結(jié)合，但是其5年存活率沒(méi)有明顯改善。臨床上常用的治療卵巢癌的化療藥物副作用較大，而且容易出現(xiàn)耐藥問(wèn)題。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討蒺藜皂苷對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所)培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清、100 U/ml青霉素的RPMI1640(GIBCO公司生產(chǎn))培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 Bax和Bcl-2免疫組化試劑盒，DAB顯色劑(武漢博士德有限公司)。環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn))。HIMAS-1000病理圖文分析系統(tǒng);流式細(xì)胞儀(FACScan，Beckman公司)。蒺藜皂苷(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度達(dá)98%)，應(yīng)用前以純凈水配成所需濃度。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，待細(xì)胞貼壁后環(huán)磷酰胺組加環(huán)磷酰胺100 mg/L，200μl;實(shí)驗(yàn)組加入100 mg/L蒺藜皂苷藥液200μl，對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌注射用水。在37℃、50%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，分別于24、48、72 h終止培養(yǎng)。在培養(yǎng)終止前4 h加入MTT 10μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 g/L SDS100μl終止培養(yǎng)，37℃過(guò)夜，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)。抑制率(%)=(A對(duì)照－A試驗(yàn))/A對(duì)照×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)蒺藜皂苷對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的影響 取70%冷乙醇固定的細(xì)胞樣品，用PBS洗2次去除殘留的乙醇，加碘化丙錠染液(4℃、避光30 min)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，測(cè)定凋亡率。

1.5 免疫組化測(cè)定Bcl-2及Bax蛋白表達(dá) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞1×105個(gè)/ml涂片，3%H2O2室溫封閉10 min，PBS沖洗，浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，高壓后冷卻至室溫。具體按常規(guī)SP法操作。Bcl-2、Bax抗體為單克隆抗體(1∶100)，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。用Image-ProPlus分析軟件進(jìn)行圖像分析，每組涂片取10個(gè)視野測(cè)定腫瘤細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物的積分吸光度，取平均值代表Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)強(qiáng)度，吸光度值越大表示陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)越強(qiáng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞抑制率的比較 與對(duì)照組(0)相比，實(shí)驗(yàn)組(61.6%)及環(huán)磷酰胺組(55.4%)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用(P＜0.05)。

2.2 各組細(xì)胞細(xì)胞周期變化的比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組使卵巢癌細(xì)胞的S期細(xì)胞比例減小，G1期細(xì)胞比例增大(P＜0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞周期變化的比較，%，n=10)

表1 各組細(xì)胞周期變化的比較，%，n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;下表同

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2.3 各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的比較 與對(duì)照組比較，蒺藜皂苷能夠降低 Bcl-2蛋白表達(dá)(P＜0.05)，增加Bax蛋白表達(dá) (P＜0.01)。見表2，圖1。

表2 各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的比較，n=10)

表2 各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的比較，n=10)

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圖1 各組Bcl-2和Bax水平比較(免疫組化)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蒺藜皂苷對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3具有明顯抑制作用，能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且蒺藜皂苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax蛋白調(diào)節(jié)有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子。Bcl-2阻止或降解細(xì)胞皺縮、DNA裂解和染色質(zhì)濃縮，在細(xì)胞凋亡的早期發(fā)揮作用〔4〕。Bcl-2過(guò)度表達(dá)后可抑制由于興奮性氨基酸、氧自由基、鈣超載等誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，阻斷細(xì)胞色素C(Cyt C)釋放，阻止 Caspase 活化，從而抑制凋亡〔5，6〕。Bax 是Bcl-2家族中的促死亡基因，與Bcl-2結(jié)合成異二聚體是Bcl-2發(fā)揮抗凋亡活動(dòng)的前提。細(xì)胞當(dāng)外界刺激時(shí)，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間協(xié)同作用，共同決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序〔7〕。

細(xì)胞周期紊亂是幾乎所有腫瘤的共同特點(diǎn)之一，而許多抗腫瘤藥物都可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期或G2/M期，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

本研究表明蒺藜皂苷能明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，通過(guò)有效增加Bax蛋白和降低 Bcl-2蛋白表達(dá)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，在腫瘤的治療領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。

1 李君玲.蒺藜皂苷化學(xué)及藥理研究概述〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006;24(8):1509-10.

2 孫 端.中藥有效成分在抗腫瘤治療中的應(yīng)用〔J〕.浙江大學(xué)學(xué)報(bào):B卷英文版，2008;9(9):585-6.

3 Hye Jin Kin，Jin Chul Kim，Jung Sun Min，et al.Aqueous extract Tribulus terrestris Linn induces cell growth arrest and apoptosis by down-regulating NF-κB signaling in liver cancer cells〔J〕.Ethnopharmacol，2011;136:197-203.

4 Yang LQ，F(xiàn)ang DC，Wang RQ，et al.Effect of NF-kappa B，survivin，Bcl-2 and Caspase-3 on apoptosis of gastric cancer cells induced by tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(1):22-5.

5 Norberg E，Orrenius S，Zhivotovsky B.Mitochondrial regulation of cell death:processing of apoptosis-inducing factor(AIF)〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2010;396(1):95-100.

6 張正茂，王夢(mèng)華，楊雪梅，等.格爾德霉素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖和凋亡的影響及其機(jī)制探討〔J〕.腫瘤，2011;31(10):899-905.

7 Chen S，Cooper M，Jones M，et al.combined activity of oridonin and wogonin in advanced-stage ovarian cancer cells:sensitivity of ovarian cancer cells to photoactive chemicals〔J〕.Cell Biol Toxicol，2011;27(2):133-47.