趙 蕊 蔡亞平 陳志寶 邵興月 賈桂燕
(八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)
馬齒莧是我國(guó)古老的藥食兼用植物。近年來(lái)研究表明,馬齒莧具有調(diào)血脂、抗動(dòng)脈硬化、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等多種藥理活性〔1〕。多糖作為一種重要的生命物質(zhì),具有多種生物活性,特別是抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用受到廣泛關(guān)注〔2〕。本文以馬齒莧為原料,研究馬齒莧多糖(PHP)亞級(jí)分對(duì)老齡荷U14宮頸癌實(shí)體瘤和腹水瘤模型小鼠的抑瘤作用。
1.1 藥品和試劑 PHP亞級(jí)分由本實(shí)驗(yàn)室制備并鑒定;環(huán)磷酰胺(CTX)購(gòu)于山西普德制藥廠;蘇木精、伊紅購(gòu)于北京中山金橋生化試劑公司。試驗(yàn)中所用其他化學(xué)試劑均為分析純。
1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 昆明種小鼠(18~22)g,由協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物研究所提供。小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株引自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,在小鼠腹腔中進(jìn)行傳代。
1.3 方法
1.3.1 PHP制備 馬齒莧→脫單糖、低聚糖→脫色→水提取→濃縮→脫蛋白→多糖沉淀→干燥→馬齒莧總多糖→離子交換層析→濃縮→脫鹽→冷凍干燥→馬齒莧多糖級(jí)分→凝膠柱層析→濃縮→冷凍干燥→PHP。
1.3.2 老齡小鼠模型制備 小鼠腹腔注射D-半乳糖(50 mg·kg-1·d-1),連續(xù) 60 d。
1.3.3 小鼠急性毒性試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)法測(cè)出小鼠口服PHP的LD50,故改作1 d內(nèi)最大耐受量試驗(yàn)。取小鼠20只,雌雄各半。試驗(yàn)前禁食(不禁水)12 h,進(jìn)行小鼠急性經(jīng)口毒理試驗(yàn),每日采用最大濃度、最大體積、一次性灌胃給藥,連續(xù)觀察7 d,記錄小鼠的行為、活動(dòng)、攝食量、體重、糞便和死亡情況,未死亡的小鼠于1 w后處死進(jìn)行尸檢〔3〕。
1.3.4 急性毒性試驗(yàn)小鼠肝臟、腎臟病理切片觀察 急性毒性試驗(yàn)小鼠連續(xù)用藥7 d后,停藥1 w后將存活小鼠斷頸處死,無(wú)菌條件下迅速取出小鼠的肝臟和一側(cè)腎臟,中性緩沖甲醛固定液進(jìn)行固定,石蠟包埋,切片機(jī)切片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。
1.3.5 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血象的變化 急性毒性試驗(yàn)小鼠連續(xù)給藥7 d后,停藥1 w,摘眼球取血,抗凝后血細(xì)胞分析儀對(duì)小鼠紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)和血紅蛋白(Hb)含量進(jìn)行檢測(cè)。
1.3.6 荷U14宮頸癌實(shí)體瘤、腹水瘤老齡小鼠模型的建立建模前小鼠禁食不禁水12 h。在無(wú)菌條件下,吸取在昆明種小鼠體內(nèi)傳代7~10 d的U14腫瘤細(xì)胞,生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml,于小鼠左前肢腋窩皮下及腹腔各接種0.2 ml,接種成功率100%。
1.3.7 試驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 腫瘤接種后24 h,實(shí)體瘤老齡小鼠模型動(dòng)物隨機(jī)分為4組,每組10只。而腹水瘤老齡小鼠模型動(dòng)物隨機(jī)分為8組,4組用于腹水瘤腫瘤抑制率的測(cè)定,每組10只;4組用于生命延長(zhǎng)率的測(cè)定,每組10只。每一試驗(yàn)的4組分別為 PHP低劑量組〔PHP(L),100 mg/kg〕、PHP高劑量組〔PHP(H),200 mg/kg〕、陰性對(duì)照組(Control,生理鹽水)和陽(yáng)性對(duì)照組(CTX,25 mg/kg)。PHP(L)、PHP(H)處理組和Control組均采用灌胃給藥,CTX對(duì)照組采用腹腔注射給藥,給藥劑量為人每千克體重臨床用藥量的12倍。所有動(dòng)物每日給藥1次,連續(xù)給藥13 d。
1.3.8 腫瘤抑制率和生命延長(zhǎng)率的測(cè)定 停藥次日脫頸處死各組小鼠,取瘤塊肉眼觀察并進(jìn)行稱(chēng)重,計(jì)算腫瘤抑制率;吸取腹腔中腹水,4%臺(tái)盼藍(lán)染色后,光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)量;停藥后讓小鼠自然死亡,記錄存活天數(shù),計(jì)算各組小鼠生命延長(zhǎng)率。
1.3.9 PHP對(duì)宮頸癌U14肺轉(zhuǎn)移的干擾作用 無(wú)菌條件下,吸取在昆明種小鼠體內(nèi)傳代7~10 d的U14腫瘤細(xì)胞,生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml,吸取0.1 ml注射入小鼠尾靜脈。分組方式如上所述,連續(xù)給藥13 d后,次日斷頸處死小鼠,迅速解剖出小鼠一側(cè)肺組織,顯微鏡下觀察肺組織并計(jì)數(shù)肺組織表面癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移克隆數(shù)〔4〕。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Origin7.5軟件包,各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,計(jì)量資料經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)為方差齊性,兩組間差異采用t檢驗(yàn),多組資料采用單因素方差分析。
2.1 PHP用藥安全性檢測(cè)
2.1.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)小鼠以PHP最大濃度最大體積進(jìn)行灌胃給藥,連續(xù)處理7 d,發(fā)現(xiàn)小鼠毛色光滑,活動(dòng)、飲食、糞便色澤與質(zhì)地均正常,1 w內(nèi)無(wú)死亡及其他異?,F(xiàn)象發(fā)生。處死后進(jìn)行尸檢,各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)經(jīng)肉眼觀察未見(jiàn)明顯異常改變。
2.1.2 肝臟、腎臟病理切片觀察 光鏡下,急性毒性試驗(yàn)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,中央靜脈居中,肝索向四周呈放射狀分布,肝細(xì)胞排列整齊,胞核清晰,胞質(zhì)豐富。急性毒性小鼠腎臟病理切片顯示,腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)明顯可見(jiàn),腎細(xì)胞排列緊密,腎小球形狀規(guī)則,腎小管結(jié)構(gòu)清楚。表明PHP對(duì)小鼠肝臟、腎臟組織沒(méi)有形成明顯的毒性反應(yīng)。見(jiàn)圖1。
2.1.3 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血常規(guī)的變化 急性毒性試驗(yàn)前、后,小鼠RBC、WBC及Hb含量均無(wú)顯著變化(P>0.05),各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi),說(shuō)明PHP對(duì)機(jī)體健康無(wú)明顯損傷。見(jiàn)表1。
表1 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血常規(guī)變化(,n=10)
表1 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血常規(guī)變化(,n=10)
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2.2 PHP體內(nèi)對(duì)老齡小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤和腹水瘤的生長(zhǎng)抑制作用 PHP(L)和PHP(H)兩組對(duì)小鼠移植性腫瘤均顯示出明顯的抑制作用,且小鼠精神狀態(tài)良好,體重平穩(wěn)增加,無(wú)死亡現(xiàn)象;Control組小鼠絕大部分精神狀態(tài)不佳,攝食量顯著減少,死亡3只,小鼠體重由于荷瘤也有所增加;而CTX組小鼠活躍,精神狀態(tài)良好,但體重增加不明顯。結(jié)果表明PHP對(duì)小鼠實(shí)體瘤具有抑制作用。為了進(jìn)一步檢測(cè)PHP體內(nèi)的抗腫瘤效果,我們通過(guò)腹腔注射U14細(xì)胞建立了老齡小鼠荷腹水型U14宮頸癌模型。結(jié)果表明,各藥物處理組小鼠腹水瘤腫瘤細(xì)胞數(shù)量均比Control組減少,提示PHP對(duì)腹水型老齡小鼠腫瘤的生長(zhǎng)存在抑制作用。見(jiàn)表2,表3。
2.3 PHP對(duì)老齡荷瘤小鼠存活時(shí)間的影響 PHP(L)、PHP(H)和 CTX組小鼠的平均生存時(shí)間分別為(21.7±4.7)、(26.9±5.4)和(32.1±5.3)d,與 Control組〔(17.8±4.7)d〕相比,存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P<0.01),其存活時(shí)間延長(zhǎng)率分別為21.93%、51.46%及80.73%。雖PHP(L)組小鼠存活時(shí)間較CTX組短(P<0.05),但PHP(H)卻與之無(wú)顯著差異(P>0.05),提示PHP對(duì)老齡荷瘤小鼠生存時(shí)間有延長(zhǎng)作用。
2.4 PHP對(duì)老齡小鼠宮頸癌U14肺轉(zhuǎn)移的干擾作用 宮頸癌U14細(xì)胞株為雙向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株,一般在接種后第7天開(kāi)始轉(zhuǎn)移,到第11天后可達(dá)80% ~100%肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在宮頸癌肺轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PHP對(duì)小鼠宮頸癌肺轉(zhuǎn)移顯示出抑制作用。轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)Control組為(137.4±20.1)個(gè),PHP(L)、PHP(H)和 CTX組分別為(103.9±15.1)、(84.7±11.8)和(90.8±17.6)個(gè),肺轉(zhuǎn)移抑制率分別為 33.82%、24.57%、38.81%,提示PHP(L)、PHP(H)均對(duì)老齡小鼠宮頸癌U14的肺轉(zhuǎn)移有抑制作用,作用效果與CTX類(lèi)似。
表2 PHP處理對(duì)小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用
表2 PHP處理對(duì)小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用
與Control組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與CTX對(duì)照組比:3)P<0.05
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表3 PHP處理對(duì)小鼠宮頸癌U14腹水瘤的生長(zhǎng)抑制作用
表3 PHP處理對(duì)小鼠宮頸癌U14腹水瘤的生長(zhǎng)抑制作用
與Control組比較:1)P<0.01;與CTX組比較:2)P<0.05
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本試驗(yàn)結(jié)果顯示,PHP(L)、PHP(H)對(duì)老齡小鼠宮頸癌的生長(zhǎng)均有顯著抑制作用,另外,PHP(L)和PHP(H)均能夠顯著延長(zhǎng)老齡荷瘤小鼠的存活時(shí)間。宮頸癌發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因,淋巴轉(zhuǎn)移是宮頸癌主要的不良預(yù)后因素之一〔5〕。因此,控制侵襲和轉(zhuǎn)移成為宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素,研發(fā)具有抗宮頸癌轉(zhuǎn)移的低毒新藥有著十分重要的意義。本研究結(jié)果表明,CTX對(duì)局部生長(zhǎng)的腫瘤和循環(huán)性腫瘤的胞毒作用效果存在一定差異。CTX在以體重減輕為代價(jià)的基礎(chǔ)上可使實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和腹水型腫瘤生長(zhǎng)受到抑制,但對(duì)循環(huán)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞這種破壞作用效果較弱。本研究結(jié)果支持局部生長(zhǎng)的腫瘤和轉(zhuǎn)移的腫瘤具有不同的化學(xué)敏感性這一觀點(diǎn)〔6〕。在特定區(qū)域快速增殖的腫瘤細(xì)胞是抗癌藥物如CTX的作用靶點(diǎn),而在血液和淋巴中循環(huán)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞受DNA-靶性抗癌藥物的影響則較小。本研究結(jié)果卻表明,PHP在老齡小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)作用的同時(shí),對(duì)小鼠宮頸癌U14的肺轉(zhuǎn)移也存在顯著的抑制作用,其機(jī)制可能是由于PHP激活的免疫細(xì)胞在血液和淋巴器官中與循環(huán)的腫瘤細(xì)胞相遇,進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行破壞所造成的,因此,PHP也大大降低了老齡小鼠宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。宮頸癌局部的侵襲與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜、多步驟、多因素相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程,具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
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